基于核酸适体LYGV1c的酶联吸附法检测石斑鱼虹彩病毒感染

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作者 刘明珠 黄静 +9 位作者 程远 韦云依 牟容丽 黄琳 竺利波 陆兰天 柯珂 陈嘉 余庆 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1-8,共8页

【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率... 【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率提供理论支持。【方法】基于生物素标记的LYGV1c(Bio-LYGV1c)开发核酸适体酶联吸附法(LYGV1c-ELASA)检测SGIV-Gx,通过对Bio-LYGV1c特异性、灵敏性、稳定性等实验评估其检测性能。通过珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)SGIV-Gx感染试验进行活体验证,同时用荧光定量PCR(qPCR)测定衣壳蛋白基因(MCP)的表达,与LYGV1c-ELASA进行比较,验证该酶联吸附法检测的可信度。【结果】LYGV1c-ELASA的方法可特异性地识别SGIV的感染,Bio-LYGV1c识别SGIV感染的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育时间为20 min,最适结合温度为4~28℃,LYGV1c-ELASA最低检测限为5×103 mL-1。活体验证结果表明,随着注射的SGIV-Gx浓度的升高,LYGV1c-ELASA检测出的石斑鱼体内病毒450 nm处的光密度(OD450)的值升高;qPCR结果表明,SGIV-Gx的MCP的表达量升高,与LYGV1c-ELASA检测结果相一致。【结论】建立的LYGV1c-ELASA技术不仅可用于体外检测,同时也适用于活体检测。LYGV1c-ELASA技术可实现对石斑鱼养殖过程中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒 检测 核酸适体 酶联吸附法

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重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

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作者 潘莹 杨家辉 +3 位作者 彭发永 黄友华 秦启伟 黄晓红 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期105-115,共11页

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplificati... 为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 ORF014L基因 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条 可视化

原文传递

石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

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作者 黄健玲 杨子敏 +5 位作者 王雨欣 李鑫帅 刘翠瑜 陈锦鹏 秦启伟 杨敏 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期391-401,共11页

[目的]获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。[方法]基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石... [目的]获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。[方法]基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)抗性的关联分析。[结果]在SGIV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到9个SNP位点,均位于内含子中;多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)的范围为0.177~0.375,其中,SNP-S1(g.940T>A)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP位点属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析结果显示,SNP-S7(g.4595T>A)基因型频率在SGIV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-S7的TT和AA这2种纯合子基因型与SGIV抗感性状相关,而AT杂合子基因型与SGIV易感性相关。在RGNNV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到8个SNP位点,其中,SNP-N1位于外显子中,属于同义突变,其余SNP均位于内含子中;PIC的范围为0.106~0.317,其中,SNP-N1(g.324G>A)和SNPN2(g.883A>G)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析表明,SNPN5(g.2510C>T)基因型频率在RGNNV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-N5的CT基因型与RGNNV抗感性状相关, CC基因型与RGNNV易感性状相关。[结论]本研究在PPAR-δ的基因组DNA序列中分别筛选到与SGIV和RGNNV抗性相关的SNP标记各1个,可以为石斑鱼抗病育种提供技术支持和理论依据。 展开更多

关键词 石斑鱼 虹彩病毒 神经坏死病毒 SNP PPAR-δ基因

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抗石斑鱼虹彩病毒药物的体外筛选

4

作者 潘赞彬 郑家颖 +4 位作者 郭茜茜 潘国俊 秦启伟 黄晓红 黄友华 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期2702-2710,共9页

【目的】体外筛选抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的药物,为石斑鱼虹彩病毒病防控提供理论依据。【方法】应用石斑鱼脾脏组织细胞系(Grouper spleen,GS)-SGIV感染模型,从4种药物[盐酸金刚烷胺(AMA)、更昔洛韦(GCV... 【目的】体外筛选抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的药物,为石斑鱼虹彩病毒病防控提供理论依据。【方法】应用石斑鱼脾脏组织细胞系(Grouper spleen,GS)-SGIV感染模型,从4种药物[盐酸金刚烷胺(AMA)、更昔洛韦(GCV)、绿原酸(CGA)和黄芩苷(BI)]中筛选有效的体外抗SGIV药物。通过显微镜观察和细胞活力检测不同药物对GS细胞的毒性,确定不同药物对GS细胞的安全工作浓度后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹分析等探究药物对SGIV感染复制的调节作用。【结果】细胞活力检测结果显示,4种药物AMA、GCV、CGA和BI处理GS细胞的最高安全工作浓度分别为200、200、1600和40μg/mL。显微镜下观察发现,AMA和GCV处理GS细胞后对SGIV感染的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)进程有明显的抑制作用,而CGA和BI没有明显抑制效果。实时荧光定量PCR检测结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)和病毒囊膜蛋白(Viral protein VP088)的基因转录(P<0.05,下同)。蛋白印迹分析表明AMA和GCV对SGIV的MCP蛋白合成具有明显抑制效果。倒置荧光显微镜观察发现AMA和GCV处理明显减少感染过程中病毒加工厂的形成,提示AMA和GCV可能影响病毒装配。病毒滴度测定结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV感染过程中子代病毒的产量。【结论】应用SGIV体外感染模型筛选到的2种药物AMA和GCV具有一定的抗SGIV活性,且这种抗病毒能力主要通过抑制病毒的基因转录和蛋白合成,从而影响病毒的装配和产量。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒 抗病毒药物 盐酸金刚烷胺(AMA) 更昔洛韦(GCV)

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细胞骨架蛋白actin参与石斑鱼虹彩病毒SGIV释放 被引量：1

5

作者 王著希 周胜 +4 位作者 黄友华 王劭雯 黄晓红 周永灿 秦启伟 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期1319-1327,共9页

在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除... 在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除了病毒编码的囊膜蛋白外,还发现7种宿主细胞来源的蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin等,由此推测这些宿主蛋白是与病毒纯化过程中共纯化获得。鉴于actin在病毒感染中发挥着重要的作用,进一步通过蛋白印迹、免疫电镜实验验证了actin与病毒共纯化,揭示actin是一种来源于宿主细胞并包装到病毒颗粒表面的宿主蛋白,且由于特异性作用黏附于病毒粒子表面,在分离病毒囊膜时与囊膜蛋白共纯化。此外,荧光显微镜观察发现,在病毒感染晚期,细胞变圆,细胞微丝actin蛋白和SGIV病毒共定位于细胞膜,提示actin与病毒释放相关。同时电镜观察也表明,病毒在感染细胞中释放时获得由宿主细胞质膜衍生而来的囊膜,由此推测actin可能在病毒释放时特异性包裹于SGIV病毒表面。研究表明,actin参与石斑鱼虹彩病毒SGIV的释放过程。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 囊膜蛋白 ACTIN 病毒释放

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石斑鱼虹彩病毒SGIV在宿主细胞内依赖微管运动的行为特征 被引量：1

6

作者 王立群 王劭雯 +1 位作者 王宏达 秦启伟 《热带海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期66-73,共8页

病毒是非常微小的简单生物,不能独立生存,必须借助宿主细胞完成自身的繁衍。病毒侵染进入细胞后,通常借助于微管通过黏稠的细胞质运动到特定的复制位点。然而,有关病毒依赖微管运动行为的精细动态研究还比较少。石斑鱼虹彩病毒(Singapor... 病毒是非常微小的简单生物,不能独立生存,必须借助宿主细胞完成自身的繁衍。病毒侵染进入细胞后,通常借助于微管通过黏稠的细胞质运动到特定的复制位点。然而,有关病毒依赖微管运动行为的精细动态研究还比较少。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)为虹彩病毒科蛙病毒属的一个新种,是海水养殖鱼类的重要病毒性病原,对海水养殖业造成重大经济损失。利用单粒子示踪技术实时追踪了SGIV病毒粒子沿微管运动的行为,观察到SGIV在细胞边缘至微管中心之间的双向运动,最高瞬时速度约0.2μm·s^–1,均表现为主动运输。病毒粒子运动至微管交叉位置会减速迂回,而后或受限于此,平均运动速率约0.008μm·s^–1,或通过交叉处继续快速运动,最高瞬时速度为0.2μm·s^–1。同时,SGIV感染会影响微管的形态结构,随着SGIV感染,微管逐渐围绕细胞核和病毒加工厂形成环状结构。研究结果初步揭示了SGIV病毒和细胞微管之间相互作用的复杂过程,丰富了我们对虹彩病毒胞内生命活动的认识,有助于深入地理解海水鱼类虹彩病毒感染致病机理。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒 单粒子示踪技术 微管 病毒运输

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石斑鱼虹彩病毒SGIV感染致病的细胞分子基础及免疫防控对策 被引量：5

7

作者 秦启伟 黄晓红 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期78-90,共13页

虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一,已从 100 多种鱼类中分离鉴定出该病毒。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离鉴定的高致病性虹彩病毒,是虹彩... 虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一,已从 100 多种鱼类中分离鉴定出该病毒。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离鉴定的高致病性虹彩病毒,是虹彩病毒科 Iridoviridae 蛙病毒属 Iridovirus 1 种新的病毒。本文从以下几个方面对 SGIV 的研究进行综述:SGIV 的形态、超微结构及其在石斑鱼细胞中的复制和装配过程;SGIV 病毒基因组、转录组、囊膜蛋白质组及 miRNAs 的解析;SGIV 感染宿主靶标组织的鉴定;病毒侵染的入侵方式、运动轨迹和胞内运输的实时追踪;SGIV 感染宿主引起类凋亡的死亡机制及介导的信号通路的揭示;多种宿主免疫抗病基因对病毒感染的调节作用;多种 SGIV 的检测技术,包括基于抗体的流式细胞技术、微流控芯片检测技术、环介导等温扩增技术及核酸适配体检测方法等;SGIV 的灭活疫苗、亚单位疫苗和 DNA 疫苗的研制等。以期为深入阐明 SGIV 感染致病机理奠定坚实的理论基础,为发展抗病毒对策提供技术支撑。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒 病原分子特征 病原宿主互作 检测技术 免疫防控

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新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF086蛋白的原核表达、纯化及抗体制备 被引量：2

8

作者 夏立群 张红莲 +1 位作者 梁海鹰 刘森林 《上海海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期1-6,共6页

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转... 新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优化,确定在0.7 mmol/L IPTG、16℃诱导14 h时可溶性SGIV ORF086重组蛋白占重组蛋白的60%。经镍琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白,纯化度达95%以上。用纯化的SGIV ORF086蛋白免疫小鼠,获得了高效特异的SGIV ORF086抗血清。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 原核表达 多克隆抗体 sgiv ORF086重组蛋白

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RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达 被引量：3

9

作者 夏立群 梁海鹰 +1 位作者 张红莲 秦启伟 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期611-617,共7页

新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转... 新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24～48h,实验细胞(共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46)和阳性对照细胞(共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46)中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照(共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46)少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72h其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24～48h可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP46基因的表达。 展开更多

关键词 RNA干扰 绿色荧光蛋白 石斑鱼虹彩病毒 感染细胞多肽ICP46

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新加坡石斑鱼虹彩病毒ICP46核输出信号序列的定位与功能鉴定 被引量：2

10

作者 夏立群 张红莲 秦启伟 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1763-1769,共7页

新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒,可导致石斑鱼死亡率达90%以上,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因,可能参与细胞的生长调控,并对病毒复制有重要... 新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒,可导致石斑鱼死亡率达90%以上,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因,可能参与细胞的生长调控,并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine,L)的潜在核输出信号(nuclear export signal,NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用,实验构建了3个NES缺失的突变体:仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)和不含NES的全长片段(ΔNESc),并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内的定位情况。转染细胞实验结果表明,野生型EGFP-ICP46重组蛋白可以有效地被输出细胞核,荧光信号主要分布在胞质区;相反,NES缺失的EGFP-ICP46-ΔNES重组蛋白不能被有效地输出细胞核,呈现与EGFP对照相同的泛细胞分布特征。突变实验证明,NES对SGIV ICP46输出细胞核具有决定性作用。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 ICP46 核输出信号 绿色荧光蛋白

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鞍带石斑鱼isg15基因cDNA克隆及其在虹彩病毒感染下的表达分析 被引量：1

11

作者 马腾 王磊 +5 位作者 赵玉柱 吴垚磊 周茜 陈张帆 朱春华 陈松林 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2021年第5期31-39,共9页

本研究利用PCR和RACE技术首次获得了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,isg15)全长序列。isg15基因序列长为910 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,可编码155个氨基酸,预测分子量为17.09... 本研究利用PCR和RACE技术首次获得了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,isg15)全长序列。isg15基因序列长为910 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,可编码155个氨基酸,预测分子量为17.09 kDa,理论等电点为9.33。保守结构域分析显示,鞍带石斑鱼ISG15蛋白包含2个类似泛素结构域,且C末端具有高度保守的“Leu Arg Leu Arg Gly Gly(LRLRGG)”结构域。序列分析和系统发育分析显示,鞍带石斑鱼与斜带石斑鱼(E.coioides)isg15的相似性最高,为88.24%,与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)isg15的相似性分别为61.18%和60.59%。采用实时荧光定量PCR技术检测了鞍带石斑鱼健康组织中的isg15表达,以及虹彩病毒(iridovirus)感染后不同时间脾脏和肾脏中的isg15表达变化。结果显示,isg15在血液中的表达量最高,在肝脏、肾脏等组织中的表达量较高。经虹彩病毒感染后,isg15在脾脏和肾脏中的表达显著升高,在72 h到达最高水平,说明isg15在鞍带石斑鱼防御虹彩病毒的过程中发挥着重要作用。对鞍带石斑鱼isg15基因的分析和表达模式的研究,有助于进一步了解isg15基因在硬骨鱼体内的抗病毒调控机制,为鞍带石斑鱼抗病分子育种提供基础数据。 展开更多

关键词 鞍带石斑鱼 虹彩病毒 ISG15 抗病毒功能基因 免疫反应

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新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF162蛋白的表达、纯化及抗体制备 被引量：1

12

作者 夏立群 梁海鹰 +1 位作者 江韶英 张尧清 《广东海洋大学学报》 CAS 2010年第1期59-64,共6页

将新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的ORF162的开放式阅读框插入pET-32a表达载体T7启动子控制下的6-His·Tag编码基因上游,构建SGIVORF162原核表达质粒pET-ORF162。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经... 将新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的ORF162的开放式阅读框插入pET-32a表达载体T7启动子控制下的6-His·Tag编码基因上游,构建SGIVORF162原核表达质粒pET-ORF162。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达SGIV ORF162融合蛋白。对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件进行优化后,确定在0.7mmol/LIPTG、16℃条件下诱导14h时可溶性SGIV ORF162重组蛋白占重组蛋白总量的95%。经镍琼脂糖凝胶纯化,获得纯度为90%以上的SGIV ORF162蛋白。用纯化的SGIV ORF162蛋白免疫小鼠,获得高效特异的SGIV ORF162多克隆抗体。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 原核表达 多克隆抗体

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新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

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作者 张红莲 夏立群 秦启伟 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期25-32,共8页

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构... 为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 ORF39L 克隆 表达 抗体 间接免疫荧光

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石斑鱼虹彩病毒ORF050的分子特征和功能初步分析 被引量：3

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作者 关丽雅 黄友华 +2 位作者 蔡佳 黄晓红 秦启伟 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1095-1105,共11页

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥... 新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥作用。本研究克隆了SGIV ORF050基因,并构建了全长基因的真核表达重组质粒和四个半胱氨酸富集结构域(CRD)分别缺失的突变体。RT-PCR和药物抑制实验结果表明,SGIV ORF050是病毒的一个立即早期基因。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞质内均匀地弥散性分布,并在细胞核周围聚集;第一个CRD缺失后,基因的定位发生明显的变化,即呈点状分布在胞质中,推测第一个CRD对其功能有影响。在过表达SGIV ORF050的鱼类细胞中观察SGIV感染引起的CPE,发现与对照相比没有明显区别;荧光定量PCR检测SGIV主要衣壳蛋白MCP的转录表达水平,也没有明显变化,提示该基因对SGIV在宿主细胞内的复制增殖可能没有影响。荧光定量PCR检测过表达ORF050的细胞在SGIV感染后宿主TNF/TNFR的转录水平,结果显示在感染10 h后TNF1、TNF2和TNFR2的表达量升高了2～3倍,而TNFR1的表达量没有明显变化,说明SGIV可能通过ORF050来调节细胞TNF和TNFR的表达,从而逃避宿主的免疫攻击。 展开更多

关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 sgiv ORF050 肿瘤坏死因子受体 分子特征 免疫逃避

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基于新型核酸适配体-荧光分子检测探针的石斑鱼虹彩病毒病快速诊断 被引量：9

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作者 李鹏飞 余庆 +6 位作者 李菲 覃仙玲 董德信 陈宪云 牙韩争 柯珂 秦启伟 《广西科学》 CAS 2018年第1期63-67,共5页

【目的】石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是引起华南沿海地区重要海水养殖鱼类石斑鱼(Epinephelus tauvina)发生病毒性鱼病的主要病毒性病原之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁华南... 【目的】石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是引起华南沿海地区重要海水养殖鱼类石斑鱼(Epinephelus tauvina)发生病毒性鱼病的主要病毒性病原之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁华南地区石斑鱼养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的SGIV快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。【方法】基于核酸适配体(Q2)就SGIV病的快速检测诊断技术进行系统研究,开发出一种新型的核酸适配体-荧光分子检测探针(Aptamer Q2-based fluorescent molecular probe,Q2-AFMP),并对Q2-AFMP检测SGIV感染的特异性、灵敏性和稳定性进行分析。【结果】Q2-AFMP可以特异性检测SGIV感染,且其灵敏性和稳定性均比较高。【结论】本研究中基于核酸适配体构建的新型高特异性荧光分子探针(Q2-AFMP)有望实现对海水养殖中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控和有效预防。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒 核酸适配体-荧光分子探针 高特异性和灵敏性 快速诊断

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真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析 被引量：1

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作者 刘冉阳 史成银 +2 位作者 谢国驷 李晨 王海波 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第3期103-112,共10页

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,... 褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无明显异常,但反应迟钝,伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现,各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 m的肿大细胞。超薄组织切片中发现,肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物,从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus,RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因1362bp的全长编码区,构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树,结果显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征,揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主,为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。 展开更多

关键词 褐龙斑 褐石斑鱼 鞍带石斑鱼 真鲷虹彩病毒 组织病理

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八角茴香水提物调控宿主免疫反应抗石斑鱼虹彩病毒的机制研究 被引量：1

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作者 李梦梦 韦红玲 +4 位作者 刘明珠 黄帅帅 王太霞 黄琳 李鹏飞 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期2756-2765,共10页

【目的】从免疫应答角度探析八角茴香(Illicium verum Hook.f.)水提物(IVE)调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光... 【目的】从免疫应答角度探析八角茴香(Illicium verum Hook.f.)水提物(IVE)调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察及CCK-8细胞活力测定确定IVE的细胞安全工作浓度,利用实时荧光定量PCR检测IVE对宿主细胞干扰素相关基因(IFN、STAT1、PKR、ISG15、KKα、STING和IRF3)表达的影响,并以光学显微镜观察和实时荧光定量PCR分析IVE在细胞水平抗SGIV的效果,通过石斑鱼活体试验进一步验证IVE的抗SGIV效果。【结果】IVE细胞水平的安全工作浓度≤0.50 mg/mL;IVE预处理GS细胞2 h可显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)激活干扰素相关基因(IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3和STING)的表达。SGIV感染GS细胞24和48 h时,经IVE预处理的细胞病变效应(CPEs)明显少于未使用IVE预处理的GS细胞,且细胞内SGIV的MCP基因相对表达量极显著降低,表明IVE可有效抑制SGIV感染;此外,IVE可增强SGIV感染GS细胞中干扰素相关基因的表达,具体表现为IFN、STAT1和IRF3基因在病毒感染后24 h极显著上调,PKR、IKKα、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h呈显著或极显著上调趋势。在石斑鱼活体试验中,IVE与SGIV混合腹腔注射后石斑鱼脾脏中SGIV的MCP基因相对表达量在病毒感染后24和48 h均极显著低于仅注射SGIV的石斑鱼。【结论】IVE具有抑制SGIV感染的功能,其作用机制可能是通过诱导干扰素相关基因表达而激活宿主的抗病毒状态,从而发挥间接抗SGIV效果;也说明八角茴香在水产疫病防控中具有研发成渔用抗病功能制剂的潜力。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒(sgiv) 八角茴香水提物(IVE) 免疫反应 抗病毒机制 干扰素

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败酱草水提物对石斑鱼虹彩病毒的抗病毒作用 被引量：4

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作者 肖贺贺 刘明珠 +9 位作者 余庆 王一兵 覃仙玲 黎思巧 吴思婷 陈宪云 董德信 朱冬琳 王太霞 李鹏飞 《广西科学院学报》 2019年第3期185-192,共8页

石斑鱼是名贵的海水养殖鱼类,随着高密度、集约化养殖的发展,各类水产疫病频繁暴发。石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus)是石斑鱼养殖中最严重的病毒性病原之一,会导致鱼大量死亡,因此研究可抑制此病毒感染的药物对石斑鱼养殖业具有重... 石斑鱼是名贵的海水养殖鱼类,随着高密度、集约化养殖的发展,各类水产疫病频繁暴发。石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus)是石斑鱼养殖中最严重的病毒性病原之一,会导致鱼大量死亡,因此研究可抑制此病毒感染的药物对石斑鱼养殖业具有重大意义。败酱草为我国传统中药,现代药理学证明,败酱草及其活性成分具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。本研究首先采用光学显微镜观察、细胞活力测定实验确定败酱草水提物的细胞安全浓度;然后结合实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)和基于核酸适配体Q5的荧光分子探针检测技术(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe assay,Q5-AFMP)等方法分析败酱草水提物在细胞水平对石斑鱼虹彩病毒的抗病毒效果。其结果显示,低于2.50 mg/mL的败酱草水提物对细胞无明显的毒性作用,即败酱草水提物对石斑鱼细胞的安全浓度为≤2.50 mg/mL,高于2.50 mg/mL的败酱草水提物会降低细胞活力,并对细胞有显著的毒性作用。光学显微镜观察、细胞活力测定、RT-qPCR和Q5-AFMP技术的检测结果均证明败酱草水提物在体外对石斑鱼虹彩病毒感染具有良好的抑制作用。说明细胞安全浓度的败酱草水提物具有良好的抗石斑鱼虹彩病毒作用,具有开发为高效的抗病毒渔用药物的潜力。 展开更多

关键词 败酱草水提物 石斑鱼虹彩病毒 抗病毒 细胞活力 核酸适配体 渔用药物

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石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白的表达及其生物学功能分析 被引量：3

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作者 肖贺贺 徐凤巧 +4 位作者 刘明珠 苏美珍 余庆 李梦梦 李鹏飞 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期806-814,共9页

【目的】明确石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的生物学功能,为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因... 【目的】明确石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的生物学功能,为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因的转录时序及其在SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达水平;将SGIV MCP基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1上,构建重组质粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP,然后以重组质粒pEGFP-N3-MCP转染石斑鱼脾细胞(Grouper spleen cell,GS)进行亚细胞定位分析,同时以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染胖头鲤细胞(Fathead minnow cells,FHM)构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系(FHM-MCP),用于分析MCP蛋白对宿主细胞生长增殖及SGIV感染压力下细胞存活率和病毒复制的影响。【结果】在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录,即MCP基因是一个晚期基因。在SGIV感染24 h后,MCP基因在石斑鱼脾脏中的相对表达量最高,其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中,而在胃和鳃组织中的相对表达量较低,提示胃和鳃组织并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。细胞生长增殖曲线和细胞计数结果均证实,MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h,FHM-MCP细胞的存活率均显著高于FHM-Vector细胞(真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞),其存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。此外,FHM-MCP细胞在SGIV感染24和48 h后,其病毒滴度均高于FHM-Vector细胞,即MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。【结论】SGIV的MCP基因是一个晚期基因,其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中,通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制,最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒(sgiv) 主要衣壳蛋白(MCP) 表达分析 亚细胞定位 宿主细胞

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桑叶水提物及异槲皮苷成分抗石斑鱼虹彩病毒作用机制研究 被引量：2

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作者 李鹏飞 肖贺贺 +3 位作者 刘明珠 李梦梦 黄亚明 余庆 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1429-1439,共11页

【目的】探究桑叶提取物成分对石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的抑制作用,并对其抗病毒机制进行研究,为利用桑叶提取物成分研发抗SGIV药物提供理论依据,也为开发高效安全的新型抗病毒渔用药物提供新思路。【方法】利用石斑鱼脾脏组织细胞系(GS),... 【目的】探究桑叶提取物成分对石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的抑制作用,并对其抗病毒机制进行研究,为利用桑叶提取物成分研发抗SGIV药物提供理论依据,也为开发高效安全的新型抗病毒渔用药物提供新思路。【方法】利用石斑鱼脾脏组织细胞系(GS),通过光学显微镜观察及CCK-8检测分析桑叶水提物(Morus alba L.water extracts,MAE)及其活性成分异槲皮苷(Isoquercetin,IQ)的安全工作浓度,然后使用实时荧光定量PCR及核酸适配体荧光分子探针技术(Q2-AFMP)分析MAE和IQ对SGIV的抗病毒效果;通过分析SGIV感染GS细胞中MCP基因和VP19基因的表达水平,分析IQ对SGIV的粒子结构及其与宿主细胞表面结合、侵入宿主细胞和在宿主细胞中复制的影响,探究IQ体外抗SGIV的作用机制。【结果】桑叶源化合物成分(MAE和IQ)对GS细胞的最高安全工作浓度为:MAE≤10.0 mg/mL,IQ≤1000.0μg/mL。与接入SGIV的GS细胞相比,在以安全工作浓度的MAE(10.0 mg/mL)和IQ(1000.0μg/mL)分别接入SGIV孵育感染的GS细胞后细胞病变(CPEs)明显减少,MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势(P<0.01,下同),GS细胞荧光值也极显著降低,表明桑叶源化合物成分能有效抑制SGIV感染。以IQ处理SGIV孵育感染的GS细胞,其细胞内MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势,提示IQ能破坏SGIV的粒子结构,并干扰SGIV对宿主细胞的吸附、侵入和复制。【结论】MAE和IQ对SGIV具有良好的抗病毒效果,其中IQ能在病毒吸附、侵入和复制阶段发挥抗病毒作用,即桑叶源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潜在的应用价值,可作为研发抗SGIV感染的有效药用成分。 展开更多

关键词 石斑鱼虹彩病毒(sgiv) 桑叶水提物(MAE) 异槲皮苷(IQ) 抗病毒机制

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