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一种蛇毒类凝血酶纯化新方法
1
作者 李秀琳 董敬 +1 位作者 刘阳 李爽 《沈阳药科大学学报》 CAS CSCD 2024年第3期351-355,共5页
目的提供一种蛇毒类凝血酶的新纯化方法。方法蛇毒经预处理后,依次经过苯甲脒琼脂糖凝胶亲和色谱、阳离子交换色谱和疏水色谱后获得蛇毒类凝血酶,分别对活性、分子量及纯度进行检测,并与使用现有专利方法制备的蛇毒类凝血酶进行质量比... 目的提供一种蛇毒类凝血酶的新纯化方法。方法蛇毒经预处理后,依次经过苯甲脒琼脂糖凝胶亲和色谱、阳离子交换色谱和疏水色谱后获得蛇毒类凝血酶,分别对活性、分子量及纯度进行检测,并与使用现有专利方法制备的蛇毒类凝血酶进行质量比较。结果新方法制备的蛇毒类凝血酶与现有专利方法相比,分子量无明显差异,但新方法的比活力更高,且纯度更高,同时新方法的工艺稳定性更佳。结论新方法与现有专利方法相比,简化了工艺步骤,缩短了纯化周期,减少了过程环境暴露风险,可获得高纯度类凝血酶,工艺稳定性高,产品质量一致性好,利于临床安全用药。 展开更多
关键词 蛇毒类凝血酶 纯化 新方法
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大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化(英文) 被引量：15
2
作者 杨青 胡学军 +4 位作者 许小明 高晓蓉 安利佳 苏志国 J.C.JANSON 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第3期390-393,共4页
根据同源性分析设计引物 ,通过RT PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因 ,之后将该基因克隆到表达载体 pPIC9K中 ,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中 .经筛选得到甲醇快速生长型转化子His+ Mut+ 在 5 0 0ml摇... 根据同源性分析设计引物 ,通过RT PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因 ,之后将该基因克隆到表达载体 pPIC9K中 ,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中 .经筛选得到甲醇快速生长型转化子His+ Mut+ 在 5 0 0ml摇瓶中培养 ,甲醇诱导分泌表达 .上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到 :QSepharoseFF和Benzamidine Sepharose 4BCL .与天然蛇毒类凝血酶一致 ,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性 ,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱 .此重组类凝血酶在 37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽 ,但在 0℃下很稳定 .该酶的最适pH为 8 0 . 展开更多
关键词 大连蛇岛 蝮蛇 类凝血酶基因 毕赤酵母 克隆 表达 分离纯化
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大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究 被引量：6
3
作者 杨青 雷旭宇 +4 位作者 许建强 李民 苏志国 安利佳 杨克瑞斯特.杨森 《大连理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第2期156-159,共4页
根据同源性设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,并由此推测出其相应的氨基酸序列.将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达.该表达产物经两步柱层析后,进行聚... 根据同源性设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,并由此推测出其相应的氨基酸序列.将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达.该表达产物经两步柱层析后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,获得单一条带,并表现较强的生色底物活性. 展开更多
关键词 大连蛇岛 蝮蛇 类凝血酶 基因克隆 基因表达 酵母表达系统 氨基酸序列 蛇毒
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蛇毒类凝血酶研究进展 被引量：8
4
作者 林奕心 余晓东 +2 位作者 和七一 宋锡迅 李恒 《重庆师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2009年第2期27-32,F0003,共7页
对有关蛇毒类凝血酶(SVTLEs)的分布分类、理化性质、酶学性质、结构特征、基因克隆表达、临床应用等方面的研究资料进行了概括和综述。结果发现:SVTLEs主要分布在蝮亚科和蝰科毒蛇的毒液中;根据SVTLEs水解纤维蛋白原释放FPA和FPB的速度... 对有关蛇毒类凝血酶(SVTLEs)的分布分类、理化性质、酶学性质、结构特征、基因克隆表达、临床应用等方面的研究资料进行了概括和综述。结果发现:SVTLEs主要分布在蝮亚科和蝰科毒蛇的毒液中;根据SVTLEs水解纤维蛋白原释放FPA和FPB的速度不同,可将其分为SVTLE-AB、SVTLE-A和SVTLE-B等3类;多数SVTLEs的分子量在30～50kD,含6个二硫键,pI较低,部分SVTLEs的pI较高;SVTLEs可水解TAME和BAEE,其活性可被DFP和PMSF所抑制,但不被胰蛋白酶trypsin及凝血活性中心His的专一抑制剂TLCK和EDTA抑制;对SVTLEs的一级结构和二级结构研究较多,对高级结构研究有待深入;很多SVTLEs基因在大肠杆菌中成功获得了表达,但表达物不能被糖基化和正确折叠,故没有活性或活性不高,而其在真核表达系统中表达活性较高;部分碳水化合物具有稳定SVTLEs结构及提高SVTLEs的酶活力的作用;SVTLEs的临床应用涉及心肌梗塞、缺血性中风、血栓性疾病等疾病的治疗。SV-TLEs未来的研究重点将集中于其在真核表达系统的表达和对其高级结构的解析。 展开更多
关键词 蛇毒 类凝血酶 SVTLEs 凝血活性 蛋白结构
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新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究 被引量：8
5
作者 唐松山 王晓华 +3 位作者 张娟辉 杨志勇 刘菁 祁荣 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2005年第7期781-786,共6页
目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均... 目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成. 展开更多
关键词 类凝血酶 止血剂 尖吻蝮蛇蛇毒 Agacutin
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蕲蛇蛇毒中一个新的类凝血酶的分离纯化与表征 被引量：6
6
作者 赖伟苹 郭春腾 +3 位作者 邓文汉 卢菀华 宁千年 饶平凡 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第1期64-67,共4页
使用DEAE SephadexA 5 0、POROS 5 0HS及POROS 2 0PI等色谱分离技术 ,从蕲蛇粗毒中分离提纯得到 1个具有凝血活力的组分 ,经SDS PAGE和PAGE检测均为一条带 ,非还原条件下相对分子质量 2 4 .3kDa,还原条件下相对分子质量 33.0kDa ;其凝... 使用DEAE SephadexA 5 0、POROS 5 0HS及POROS 2 0PI等色谱分离技术 ,从蕲蛇粗毒中分离提纯得到 1个具有凝血活力的组分 ,经SDS PAGE和PAGE检测均为一条带 ,非还原条件下相对分子质量 2 4 .3kDa,还原条件下相对分子质量 33.0kDa ;其凝血活力为 91 .0NIHu mg.该组分不具有激活因子ⅩⅢ的活性 ,肝素不影响该组分的凝血活性 ,EDTA部分抑制其活性 ,苯甲基磺酰氟 (PMSF)则会产生不可逆抑制作用 .该酶N 末端氨基酸序列为VIGGNGXDINEHRFLVAFF 。 展开更多
关键词 蕲蛇蛇毒 类凝血酶 分离纯化 表征 N-末端氨基酸序列
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在大肠杆菌中表达蝮蛇毒类凝血酶基因gloshedobin 被引量：6
7
作者 黄星 杨青 +1 位作者 闫明 刘铮 《过程工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第1期22-27,共6页
将大连蛇岛蝮蛇毒腺中的类凝血酶基因gloshedobin克隆到pET-32a(+)上,构建了T7启动子控制的大肠杆菌表达质粒,并考察了质粒的稳定性. 采用IPTG诱导,以融合蛋白的形式进行表达,得到以包涵体形式存在的类凝血酶. 通过实验对诱导时间、诱... 将大连蛇岛蝮蛇毒腺中的类凝血酶基因gloshedobin克隆到pET-32a(+)上,构建了T7启动子控制的大肠杆菌表达质粒,并考察了质粒的稳定性. 采用IPTG诱导,以融合蛋白的形式进行表达,得到以包涵体形式存在的类凝血酶. 通过实验对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行了优化,并采用正交实验考察了金属离子对表达的影响,结果表明Fe3+, Co2+对类凝血酶的表达有促进作用. 展开更多
关键词 蛇毒类凝血酶 包涵体 基因表达 金属离子 正交实验 融合蛋白
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五步蛇蛇毒类凝血酶N端的部分氨基酸序列 被引量：7
8
作者 杜晓燕 朱洪 +2 位作者 蒋克贤 俞鹤年 周元聪 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1997年第2期184-185,共2页
从五步蛇蛇毒中纯化得到的类凝血酶 ,在SDS PAGE及IEF均为一条带 ,且分子质量约 38ku ,等电点约为 4 0。测定该酶N端 1 5个氨基酸的序列是VIGGVECDINEHRFL 。
关键词 蛇类 蛇毒 五步蛇 类凝血酶 N端 序列 氨基酸
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蛇毒类凝血酶的研究进展 被引量：30
9
作者 傅宏义 周磊 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期245-247,共3页
目的介绍蛇毒类凝血酶的研究进展,提示医务人员正确使用各种类凝血酶制剂。方法查阅国内外文献进行分析和总结。结果不同蛇种来源的类凝血酶组分、结构、对血液系统的作用都存在不同程度的差异,有些具有促凝作用,有些凝血活性短暂,最终... 目的介绍蛇毒类凝血酶的研究进展,提示医务人员正确使用各种类凝血酶制剂。方法查阅国内外文献进行分析和总结。结果不同蛇种来源的类凝血酶组分、结构、对血液系统的作用都存在不同程度的差异,有些具有促凝作用,有些凝血活性短暂,最终表现为降纤、抗凝作用。结论目前部分蛇毒类凝血酶名称及其制剂名称较为混乱,应用时应对各种类凝血酶制剂加以区别,正确使用。 展开更多
关键词 蛇毒类凝血酶 血凝酶 巴曲酶 促凝作用 抗凝血作用
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尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化 被引量：12
10
作者 翟宁 陈正杰 +1 位作者 冯军 赵文杰 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期601-603,共3页
用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分。经Superdex75HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%。SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k。该组分的凝血酶比活为41.... 用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分。经Superdex75HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%。SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k。该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ。EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用。结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶。 展开更多
关键词 类凝血酶 尖吻蝮蛇毒 柱色谱
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大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达与纯化 被引量：6
11
作者 雷旭宇 杨青 +3 位作者 包永明 许建强 栾雨时 安利佳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第9期44-48,共5页
将编码大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 (Gloshedobin)的基因克隆于表达载体pET 32a( + )中 ,以融合蛋白形式在大肠杆菌中获得表达。在 2 5℃下经 1mmol LIPTG诱导 6h ,SDS PAGE和蛋白质印迹分析表明 ,部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌的细... 将编码大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 (Gloshedobin)的基因克隆于表达载体pET 32a( + )中 ,以融合蛋白形式在大肠杆菌中获得表达。在 2 5℃下经 1mmol LIPTG诱导 6h ,SDS PAGE和蛋白质印迹分析表明 ,部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌的细胞质中。针对金属螯合亲和层析分离某些含His 标签重组蛋白质时专一性不高 ,并且存在配基泄漏的缺陷 ,设计合成了以抗重组类凝血酶的鸡卵黄免疫球蛋白为配基的免疫亲和层析柱。通过疏水色谱OctylSepharoseFF ,IgY免疫亲和层析以及强阴离子交换色谱SourceQ等三步柱色谱分离纯化获得比活力为 45 4 7U mg的重组蛇毒类凝血酶 ,活力回收率为 34 8%。蛋白质印迹分析和纤维蛋白原凝结活性分析表明 。 展开更多
关键词 蝮蛇 类凝血酶 大肠杆菌 融合蛋白 蛋白质印迹 配基 ET 蛇类 蛇岛 重组蛋白质
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尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析 被引量：4
12
作者 张艳宇 马平 +5 位作者 陆一鸣 吕丽萍 姜升阳 周锡鹏 孙树汉 许金波 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期542-547,共6页
为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5'和3'保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。... 为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5'和3'保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。结果表明:该特异性片段中有一个783bp的开放阅读框架,其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98.5%的同源性,也具有蛇毒类凝血酶的典型特征。结论:本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因。 展开更多
关键词 尖吻蝮蛇 蛇毒类凝血酶 RT-PCR 生物信息学
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长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶制品的生化分析 被引量：5
13
作者 杨帆 郭慧云 +2 位作者 许航 曹海石 刘兰英 《吉林大学自然科学学报》 CAS CSCD 1999年第2期79-82,共4页
对长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的理化及酶学性质进行系统研究． 结果表明， 该酶为一分子量为３８ ０００， 等电点为４５０ 并对温度有很高稳定性的糖蛋白， 该酶的最适ｐ Ｈ 值为８０，其活力可被 Ｄ Ｆ Ｐ 和 Ｐ Ｍ Ｓ Ｆ抑制．
关键词 长白白眉蝮蛇 蛇毒 类凝血酶 酶学性质 生化分析
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类凝血酶效价测定方法的研究 被引量：7
14
作者 郝苏丽 沈佳 孙磊 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 1997年第3期134-136,共3页
对蛇毒中提取的类凝血酶进行了分析，并建立了类凝血酶效价测定法，此法灵敏度高，重视性好，操作简便，适用于蛇毒有效成分的分析及厂方质量的跟踪检测。
关键词 类凝血酶 效价测定法 蛇毒
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发色底物法测定注射用降纤酶中类凝血酶的含量 被引量：5
15
作者 雷丹青 刘绵林 周先丽 《中国现代应用药学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期482-483,共2页
目的建立发色底物法测定注射用降纤酶类凝血酶的方法.方法以Be-Phe-Val-Arg-PNA为发色底物,检测波长405nm.结果降纤酶在2～10单位/mL范围内呈良好的线性关系,r=0.9993(n=5).结论本法简便,准确,专属性强,适用于产品的质量控制.
关键词 降纤酶 类凝血酶 发色底物 含量测定
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尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状 被引量：40
16
作者 欧光武 李威 《中国医药导报》 CAS 2010年第12期9-11,共3页
尖吻蝮蛇类凝血酶是我国正在研究的一种新止血药,其结构与以往的类凝血酶完全不同。目前的研究表明,该凝血酶具有良好的止血效果及广阔的临床应用前景。
关键词 尖吻蝮蛇 蛇毒类凝血酶 研究现状
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一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究 被引量：16
17
作者 唐松山 滕达 王晓华 《徐州医学院学报》 CAS 2005年第4期308-312,共5页
目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间... 目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30min药效达高峰,药效持续24h。与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5～2.0U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%)。结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成。所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂。 展开更多
关键词 类凝血酶 止血剂 尖吻蝮蛇 蛇毒 血液凝固 Agacutin 药效学
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蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 被引量：5
18
作者 李民 杨青 +3 位作者 包永明 雷旭宇 许建强 安利佳 《无锡轻工大学学报（食品与生物技术）》 CSCD 北大核心 2003年第2期22-25,共4页
将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞... 将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化.通过SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度,采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析,显示纯化产物具有较高生物活性. 展开更多
关键词 类凝血酶 固定化金属亲和层折 融合表达 大肠杆菌
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蛇毒类凝血酶的研究进展 被引量：12
19
作者 李民 杨青 +2 位作者 包永明 许小明 安利佳 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第S1期61-66,共6页
已在40余种蛇毒中发现类凝血酶成份,其有效的体内抗凝、体外促凝作用逐渐受到关注.对它的性质结构及制备纯化的研究取得重要成果.在揭示酶的功能与结构关系以及临床抗血栓应用方面前景广阔.
关键词 蛇毒 类凝血酶 丝氨酸蛋白酶 功能与结构
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一种检测凝血酶、类凝血酶的新方法——纤维蛋白原平板法 被引量：11
20
作者 廖共山 班建东 《广西医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第6期967-968,共2页
目的:创建一种定量检测凝血酶(Thrombin)、类凝血酶(Thrombin-likeenzymes)活性的新方法——纤维蛋白原平板法。方法:采用纤维蛋白原作为底物,用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原平板,以凝血酶、类凝血酶标准品分别在该平板上的扩散... 目的:创建一种定量检测凝血酶(Thrombin)、类凝血酶(Thrombin-likeenzymes)活性的新方法——纤维蛋白原平板法。方法:采用纤维蛋白原作为底物,用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原平板,以凝血酶、类凝血酶标准品分别在该平板上的扩散反应,制作相应的标准曲线及回归曲线,并对凝血酶、类凝血酶活性作定量测定。结果:本法制作的凝血酶、类凝血酶检测标准曲线具有良好的线性关系(r=0.9994、r=0.9997)。结论:纤维蛋白原平板法可用于凝血酶、类凝血酶定量测定。具有操作简便、直观、稳定、敏感度高,不受检品浊度或颜色干扰且成本低廉等特点。 展开更多
关键词 凝血酶 类凝血酶 纤维蛋白原 平板法 活性
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