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谷氨酸对视神经脑膜上皮细胞的兴奋性毒性作用及其氧化应激机制 被引量：3
1
作者 辛晓蓉 巩天祥 +1 位作者 洪缨 党鸿 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期432-437,共6页
背景作为脑脊液－视神经屏障的主要细胞成分，视神经脑膜上皮细胞（MECs）直接与脑脊液相接触，脑脊液中的组分改变可影响MECs的功能，进而对视神经的功能产生不利影响。 目的探讨脑脊液中兴奋性神经递质谷氨酸对MECs功能的影响，为视... 背景作为脑脊液－视神经屏障的主要细胞成分，视神经脑膜上皮细胞（MECs）直接与脑脊液相接触，脑脊液中的组分改变可影响MECs的功能，进而对视神经的功能产生不利影响。 目的探讨脑脊液中兴奋性神经递质谷氨酸对MECs功能的影响，为视神经疾病发病机制的研究提供新的线索。方法将培养的人MECs株制备成悬液并接种于96孔培养板中，密度为1×104/孔，分别在培养液中用添加100、200、400、600、800和1 000 μmol/L谷氨酸孵育12、24、36、48和72 h，未添加谷氨酸者作为正常对照组，采用MTS法测定各组MECs的增生率（吸光度A490）值。采用600 μmol/L谷氨酸分别孵育MECs 24 h和48 h，未添加谷氨酸者作为正常对照组，采用实时定量PCR法检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）mRNA和热休克蛋白90（HSP90）mRNA的相对表达量；采用ELISA法检测细胞的总抗氧化能力（T-AOC），并通过荧光探针DCFH-DA观察细胞活性氧（ROS）的荧光强度。结果培养MECs生长良好，培养后72 h约80%细胞达到融合。不同浓度谷氨酸培养组随着谷氨酸浓度的增加及作用时间的延长细胞增生率逐渐下降，总体比较差异均有统计学意义（F浓度＝52.501，P〈0.001；F时间＝8.505，P〈0.001）。实验后24 h和48 h谷氨酸处理组细胞中SOD mRNA相对表达量均明显低于同时间点正常对照组，差异均有统计学意义（t＝20.278、t＝16.724，均P〈0.001）；谷氨酸作用MECs后24 h细胞中HSP90 mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（t＝5.065，P＝0.002）。实验后24 h谷氨酸处理组细胞中T-AOC活性为（30.835±2.094）nmol/（min·L），低于正常对照组的（32.873±2.317）nmol/（min·L），但差异无统计学意义（t＝1.599，P＝1.414）；实验后48 h谷氨酸处理组细胞中T-AOC活性为（29.561±1.831）nmol/（min·L），低于正常对照组的（33.680±2.039）nmol/（min·L），差异有统计学意义（t＝3.682，P＝0.004）。谷氨酸处理组细胞中ROS荧光强于正常对照组，谷氨酸处理组处理后24 h及48 h细胞中ROS含量分别为48.110±1.712和40.982±1.853，均明显高于正常对照组的36.608±1.009和37.153±1.424，差异均有统计学意义（t＝14.178，P〈0.001；t＝4.012，P＝0.002）。结论谷氨酸可抑制体外培养MECs的增生，其对MECs的兴奋毒性作用与氧化应激刺激作用有关。 展开更多
关键词 谷氨酸 脑膜上皮细胞 视神经 氧化应激反应 兴奋性氨基酸/毒性作用 细胞增生/药物作用 人 培养细胞
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白细胞介素-6对糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化的促进作用和角膜上皮愈合的加速作用 被引量：7
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作者 董亚慧 陈鹏 +2 位作者 张真真 冯璐 周庆军 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期423-431,共9页
背景白细胞介素（IL）-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用，但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨。目的探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制。方法正常6... 背景白细胞介素（IL）-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用，但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨。目的探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制。方法正常6～8周龄C57BL/6小鼠52只，采用随机数字表法随机分为正常对照鼠32只和糖尿病模型鼠20只，采用50 mg/kg链脲佐菌素连续腹腔内注射5 d的方法诱导建立小鼠糖尿病模型。正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠均行角膜上皮刮除术，然后分别于刮除后即刻和48 h结膜下注射IL-6或等容量PBS，采用荧光素染色法评价随时间延长的角膜上皮的愈合情况。体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞（TKE2细胞系），采用结晶紫染色法评估不同质量浓度IL-6处理后细胞克隆率（CFE），并与空白对照组进行比较；采用免疫荧光检测法和Western blot法检测细胞和小鼠再生上皮中干细胞标志物ΔNP63、Ki67的表达以及关键转录因子STAT3磷酸化水平；采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测小鼠角膜再生上皮中IL-6的mRNA及蛋白水平。结果角膜荧光素染色检查显示，正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠PBS注射组与IL-6注射组注射后24、48和72 h残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比随角膜上皮损伤后时间延长均明显缩小，同时间点IL-6注射组角膜上皮缺损面积均明显小于PBS注射组，组间总体差异均有统计学意义（正常对照组：F分组＝19.982，P〈0.01；F时间＝589.350，P〈0.01；糖尿病组：F分组＝25.411，P〈0.01；F时间＝334.807，P〈0.01）。空白对照组及10、20、50、100 ng/ml IL-6处理组CFE分别为（13.23±1.12）%、（15.87±1.30）%、（21.69±1.62）%、（25.33±1.28）%和（18.67±1.54）%，随着IL-6质量浓度的增加CFE逐渐增加，总体比较差异有统计学意义（F＝35.547，P〈0.01）。50 ng/ml IL-6处理5、10、15、30和60 min细胞中ΔNP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量随着处理时间的延长均逐渐增加，各时间点细胞中ΔNP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。糖尿病组和正常对照组小鼠角膜上皮刮除后24 h的再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.45±0.21和1.00±0.16，糖尿病组小鼠角膜再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量较正常对照组小鼠下降56%，差异有统计学意义（t＝3.42，P＝0.03），糖尿病小鼠角膜上皮刮除后48 h的再生上皮中IL-6蛋白质量浓度为（257±12）ng/μl，明显低于正常对照组小鼠的（323±17）ng/μl，差异有统计学意义（t＝5.60，P〈0.01）。结论IL-6能够通过激活STAT3信号通路促进正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞的活化和增生，进而促进角膜上皮修复，而封闭内源性IL-6则会延迟小鼠角膜上皮的修复。 展开更多
关键词 白细胞介素-6 角膜损伤 细胞增生/药物作用 STAT3转录因子/代谢 损伤修复/药物作用 糖尿病 角膜上皮干细胞 近交系C57BL小鼠
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胰岛素样生长因子-1对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的促生长作用 被引量：9
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作者 代佳灵 何为民 罗梦绮 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期805-810,共6页
背景甲状腺相关眼病（TAO）是一种自身免疫性疾病，目前对其发病机制的研究主要集中在共同抗原上。胰岛素样生长因子-1（IGF．1）功能的发挥需要IGF-1受体（IGF-1R）的参与，IGF-1在促甲状腺激素受体（TSHR）的信号传导通路中也起着重... 背景甲状腺相关眼病（TAO）是一种自身免疫性疾病，目前对其发病机制的研究主要集中在共同抗原上。胰岛素样生长因子-1（IGF．1）功能的发挥需要IGF-1受体（IGF-1R）的参与，IGF-1在促甲状腺激素受体（TSHR）的信号传导通路中也起着重要作用。目的探讨IGF-1对TAO患者眼眶成纤维细胞（OFs）增生及IGF-1R、TSHR表达的影响，探讨IGF-1在TAO发病机制中的作用。方法收集2016年3-6月于四川大学华西医院行TAO眼眶脂肪切除术取得的眶组织标本17例17份及正常人美容手术取得的眼眶组织4人4份，采用含体积分数5％胎牛血清的DMEM／F12培养液培养OFs。分别于培养液中加入不同质量浓度（O、50、100、125μg／L）的IGF-1，采用MTS比色法绘制OFs生长曲线，评估IGF-1对TAO和正常来源OFs增生的影响；采用流式细胞术测定不同质量浓度IGF-1对TAO和正常来源OFs中IGF-1R、TSHR表达水平的影响。结果TAO患者与正常人来源的OFs均生长良好，呈梭形，细胞质丰富，TAO患者与正常人来源的OFs形态学特点一致。培养的OFs波形蛋白呈阳性反应，结蛋白、S-100、肌红蛋白和角蛋白均呈阴性反应。不同质量浓度IGF-1作用后TAO组和正常组OFs增生均呈逐渐上升趋势，总体比较差异有统计学意义（F分组=219．639，P〈0．001；F质量浓度=17．752，P〈0．001），以100μg／LIGF-1的促进作用最强。0、50、100、125μg／LIGF-1作用后TAO组OFs中IGF-1R表达量分别为（0．0091±0．0087）％、（0．0953±0．0233）％、（0．0837±0．0227）％和（0．0709±0．0241）％，正常组OFs中IGF-1R表达量分别为（0．0023±0．0006）％、（0．0093±0．0012）％、（0．0073±0．0015）％和（0．0083±0．0012）％，其中50、100和125μg／LIGF-1作用后各组OFs中IGF-1R表达量均高于无添加IGF-1者，TAO组OFs细胞中IGF-1R的表达量均明显高于正常组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；0、50、100和125μg／LIGF-1作用后TAO组和正常组OFs中TSHR表达量的总体比较差异均无统计学意义（F分组=0．133，P〉0．05；F质量浓度=0．004，P〉0．05）。结论IGF-1对TAO患者和正常人OFs的生长均有促进作用并能上调OFs中IGF-1R的表达，但其对OFs中TSHR的表达变化无明显影响。 展开更多
关键词 甲状腺相关眼病 眼眶成纤维细胞/代谢 胰岛素样生长因子-1/代谢 胰岛素样生长因子-1受体/代谢 促甲状腺激素受体/代谢 细胞增生/药物作用 细胞培养
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miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制 被引量：1
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作者 朱江 任梅 许治国 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期695-702,共8页
背景研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附，并对肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）含量的变化进行调控，进而影响血管的生成，但miR-375是否于预视网膜新生血管的形成鲜见报道。目的探讨miR-375对缺氧诱导的人视网... 背景研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附，并对肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）含量的变化进行调控，进而影响血管的生成，但miR-375是否于预视网膜新生血管的形成鲜见报道。目的探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs）功能的影响及其可能的作用机制。方法用IMDM完全培养液培养HRCECs，并将细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl2＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组和CoCl2＋miR-375抑制剂对照组，待细胞生长至对数生长期后用200μmol／LCoCl2处理HRCECs以制备缺氧细胞模型；制备终浓度为50nmol／L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA（siRNA）-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4（FZD4）siRNA转染各组细胞48h。采用MTT法检测各组细胞的增生情况（A值）并计算增生倍数；采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目；采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白（VE—cadherin）含量；采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR．375mRNA和FZD4mRNA的相对表达量变化；采用Westernblot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化；采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度。将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋mock组和CoCl2＋FZD4siRNA组，采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达。结果miR-375处理组miR-375mRNA相对表达量明显高于正常对照组，miR-375拟似剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组，miR-375抑制剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组，差异均有统计学意义（t=-19．237、8．764，均P〈0．01），提示miR-375的转染效率较高。正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl2＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组、CoCl2＋miR．375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE—Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义（F=24．324、26．776、14．113、19．225、15．040，均P〈0．001），CoCl2＋miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE—cadherin量均较CoCl2＋miR-375拟似剂对照组明显减少，而CoCl2＋miR-375抑制剂组较CoCl2＋miR-375抑制剂对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl：＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组、CoCl2＋miR-375抑制剂对照组细胞中B—catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义（F=11．753、13．283、16．770、10．334，均P〈0．001），CoCl2＋miR-375拟似剂组细胞中B．catenin、cyclinDl、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2＋miR-375拟似剂对照组均明显下降，CoCl2＋miR-375抑制剂组较CoCl2＋miR-375抑制剂对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。CoCl，处理组和CoCl2＋mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加，CoCl2＋FZD4siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl2＋mock组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力，其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关。 展开更多
关键词 微小RNA/生理 视网膜 血管内皮细胞 病理性新生血管形成 信号转导/生理 Wnt相关蛋白/代谢 细胞增生/药物作用 基因表达调控
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