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Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化
1
作者 文廷浩 李远迪 +5 位作者 何可可 宋雯茜 王先斌 高杰 苏敏 胡蓉 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2024年第13期1996-2001,共6页
背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身... 背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。 展开更多
关键词 WNT信号通路 自身免疫调节因子 胚胎干细胞 胸腺上皮祖细胞 内胚层细胞
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基于胚胎干细胞模型的Cry1Ab蛋白发育毒性
2
作者 简远志 王菲 +2 位作者 尹宁 周若宇 王军波 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期213-222,共10页
目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性。方法:设置Cry1Ab蛋白7个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, ... 目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性。方法:设置Cry1Ab蛋白7个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3。通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50%inhibition concentration of growth and viability, IC_(50))。设置Cry1Ab蛋白5个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以5-FU为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies, EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50%inhibition concentration of differentiation, ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction, qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5和β-MHC)的mRNA表达情况。结果:5-FU的IC_(50,3T3)为46.37μg/L,IC_(50,ES)为32.67μg/L,ID_(50,ES)为21.28μg/L,根据判别函数结果将5-FU分类为强胚胎毒性物质。不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P>0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P<0.05),且具有剂量依赖趋势(P<0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P<0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验模型中未观察到31.25~2 000.00μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性。 展开更多
关键词 Cry1Ab蛋白 发育毒性 心肌细胞 细胞分化 胚胎干细胞
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利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性
3
作者 简远志 王菲 +2 位作者 周若宇 尹宁 王军波 《食品与药品》 CAS 2024年第2期97-102,共6页
目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body... 目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和维生素D3(500μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和I型胶原的基因表达情况。结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和I型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125~2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性。 展开更多
关键词 Cry1Ab蛋白 成骨分化 发育毒性 胚胎干细胞
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LMO4在小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞和血管生成中的作用
4
作者 项明华 涂珍珍 +1 位作者 王月 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第1期1-7,共7页
目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)... 目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)启动子驱动表达Gfp的载体(pFG),构建成血管细胞特异性表达的LMO4的载体pFLG。将表达载体转染mESC,通过遗传霉素(G418)筛选,获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株;将这些mESC在体外进行自我分化,以形成4 d和10 d的胚胎体(EB),并进行成血管细胞的集落细胞形成实验(BL-CFC);以10 d-EB进行新生血管出芽实验,观察和分析出芽长短、数目;运用蛋白免疫印迹(Western blot)或定量RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测。结果PCR结果证实成功构建了成血管细胞特异性表达的LMO4的表达载体pFLG。通过G418筛选获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株。这些mESC通过自我分化形成4 d-EB和10 d-EB,荧光显微镜下观察到EB内均可见绿色荧光标记的细胞。Western blot检测显示:与mESC相比,4 d-EB和10 d-EB的LMO4的表达显著增加。过量表达LMO4的mESC/pFLG产生BL-CFC效率为(7.70%±1.27%),而mESC/pFG细胞产生BL-CFC效率为(1.15%±0.48%),二者差异有统计学意义(P=0.021)。定量RT-PCR结果显示,Flk-1、C-kit、Tie-2、Ve-cad基因在10 d-EB/pFLG中的表达,均较10 d-EB/pFG中表达增加2倍以上。新生血管出芽实验结果显示,10 d-EB/pFLG的新生血管数量和长度均较10 d-EB/pFG增加(P<0.05)。结论过量表达LMO4促进mESC形成成血管细胞,并有利于血管内皮细胞的分化和血管的新生。 展开更多
关键词 小鼠胚胎干细胞 胚胎体 成血管细胞 血管内皮细胞 新生血管
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Pladienolide B对牛胚胎干细胞多能性相关基因表达及细胞活力的影响
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作者 赵芳 丁强 +5 位作者 夏淑雯 高运东 兰国成 林志平 王慧利 仲跻峰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期2186-2201,共16页
【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性,在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而,BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏,很多机制仍不清楚。【目的... 【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性,在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而,BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏,很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B(PlaB)对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响,为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响,利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响,利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平;PlaB浓度为1.5nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降;PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外,PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平;PlaB浓度为1—1.5 nmol·L^(-1)时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平,而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达,而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达,但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势,但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达;降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力,仍需要进一步研究以优化培养体系。 展开更多
关键词 牛胚胎干细胞 Pladienolide B 剪接体 多能性相关基因 细胞活力
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基于RNA-seq的甲氨蝶呤处理sv129胚胎干细胞的转录组学分析
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作者 王芳 包怡华 +2 位作者 李建婷 谢秋 张霆 《山西医科大学学报》 CAS 2023年第6期808-813,共6页
目的利用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术探讨抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)处理的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)基因转录表达的变化,并探讨其可能影响的生物学过程和关键信号通路。方法将mESC... 目的利用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术探讨抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)处理的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)基因转录表达的变化,并探讨其可能影响的生物学过程和关键信号通路。方法将mESC分为两组,其中对照组采用完全培养基培养,MTX组在此基础上加入0.12μmol/L MTX药物处理。MTX处理24 h分别收集细胞,提取总RNA进行RNA-seq,获得胚胎早期全基因转录组图谱并采用Deseq2软件筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),采用生物信息学R软件包对MTX组与对照组进行差异基因的功能及通路分析。结果MTX组与对照组的转录组相比,共有365个DEGs,其中144个显著上调表达,221个显著下调。GO(Gene Ontology)功能富集分析显示,生物学过程(biological process,BP)分类集中在肌肉系统发育、肌肉收缩、肌纤维发育等肌肉系统发育过程,细胞组分(cellular component,CC)分类集中在细胞膜组分、肌原纤维、收缩纤维、肌丝、肌节等肌肉组分,分子功能(molecular function,MF)分类集中在跨膜转运蛋白结合活性及膜通道活性。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物功能分析显示DEGs显著性富集的通路在钙信号通路、紧密连接。结论抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤能够引起mESC基因组的转录改变,DEGs功能主要与肌肉发育以及肌肉纤维发育相关,同时DEGs富集的关键信号通路主要有肌肉发育相关的膜通道的钙离子信号通路和紧密连接。 展开更多
关键词 转录组测序 甲氨蝶呤 差异表达基因 叶酸 胚胎干细胞
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S100A9促进胚胎干细胞向神经前体细胞分化中顶端—基底极化和神经管形成
7
作者 张翔 岳建和 黄宁 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期10-18,共9页
目的 探讨胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向神经前体细胞(neural progenitor cells, NPCs)分化过程中S100A9促进顶端-基底极化(apical-basal polarity, ABP)和神经管结构形成的作用。方法 采用免疫荧光观察体外培养ESCs向NPCs... 目的 探讨胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向神经前体细胞(neural progenitor cells, NPCs)分化过程中S100A9促进顶端-基底极化(apical-basal polarity, ABP)和神经管结构形成的作用。方法 采用免疫荧光观察体外培养ESCs向NPCs分化1、2、3和6 d时细胞管腔样结构排列,神经巢蛋白(Nestin)和配对盒因子6(paired box protein 6, Pax-6)表达,以及S100A9、N-钙粘蛋白(N-cadherin)和zonula occludens 1(ZO-1)定位变化。慢病毒转染下调S100A9及外源性S100A9重组蛋白干预细胞后检测对N-cadherin和ZO-1定位的影响。Western blot分析S100A9在ESCs向NPCs分化过程中不同时间点表达差异,同时观察S100A9对Notch1及下游centromere binding factor 1(CBF1)的调控。结果 ESCs在体外定向分化后第3天起表达Nestin和Pax-6,N-cadherin和ZO-1定位于顶端侧并呈现出ABP特征性神经玫瑰花状结构(neural rosette),细胞在第6天形成神经管结构。S100A9在分化后第3天起表达明显增加(P<0.01)并定位于顶端侧。下调S100A9后ESCs仍能分化为NPCs,但neural rosette数量明显减少(P<0.01)。予以外源性S100A9重组蛋白可部分恢复neural rosette数量(P<0.01)。在此分化过程中,下调S100A9降低Notch1及下游CBF1表达。结论 S100A9可能通过调控Notch1/CBF1参与ESCs向NPCs分化过程中ABP和神经管结构形成。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 神经前体细胞 顶端-基底极化 神经管 S100A9
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孤雌胚胎干细胞在细胞移植和治疗上的应用
8
作者 征月良 《邵阳学院学报（自然科学版）》 2023年第5期103-109,共7页
研究发现,卵子孤雌激活后,从囊胚中获得孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs),pESCs表达多能性标志物,发生表观遗传修饰重编程。它们具有高度的分化潜能,在体内可产生畸胎瘤,在体外能形成类胚体。pESCs能分化... 研究发现,卵子孤雌激活后,从囊胚中获得孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs),pESCs表达多能性标志物,发生表观遗传修饰重编程。它们具有高度的分化潜能,在体内可产生畸胎瘤,在体外能形成类胚体。pESCs能分化成多种类型的细胞,已被用于细胞移植治疗研究。用pESCs分化来的成纤维细胞构建皮肤组织,移植到皮肤缺损处,能促进伤口愈合。源自pESCs的成骨细胞、成软骨细胞和肌腱细胞接种到支架上并移植到皮下后,能再生出骨、软骨和肌腱组织,从而可以为治疗这些组织的损伤提供细胞来源。pESCs分化产生的心肌细胞移植到患急性心肌梗死的宿主心脏后,可改善心脏功能。由pESCs分化的神经干细胞或神经元移植到受损大脑或患帕金森病的宿主大脑后,也能促进大脑皮层的修复,改善宿主的运动缺陷。因此,pESCs在临床上具有重要的应用和推广价值,从而为疾病的细胞移植治疗提供理论依据和临床应用策略。 展开更多
关键词 孤雌胚胎干细胞 分化 细胞移植 细胞治疗 疾病
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人胚胎干细胞自分泌巨噬细胞迁移抑制因子及受体表达 被引量：1
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作者 魏艳召 郑晓晗 +4 位作者 高仕君 黄婷 魏续芳 陈薪旭 赵振强 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2023年第1期34-41,共8页
背景:胚胎干细胞由于其自我更新和多向分化特性在帮助理解细胞发育以及再生医学、组织工程和细胞治疗方面潜力巨大,为能更加深入理解和有效运用人胚胎干细胞,探索发现影响人胚胎干细胞增殖存活的潜在分子是十分必要的。巨噬细胞迁移抑... 背景:胚胎干细胞由于其自我更新和多向分化特性在帮助理解细胞发育以及再生医学、组织工程和细胞治疗方面潜力巨大,为能更加深入理解和有效运用人胚胎干细胞,探索发现影响人胚胎干细胞增殖存活的潜在分子是十分必要的。巨噬细胞迁移抑制因子在人类多种细胞中表达,起初认为主要参与炎症发生,但后来发现它在细胞增殖、分化、血管生成和肿瘤发生中发挥重要作用,但是人胚胎干细胞是否表达这种重要因子以及其在人胚胎干细胞中的功能仍不清楚。目的:明确人胚胎干细胞是否表达巨噬细胞迁移抑制因子及其相关受体,确定何种受体与巨噬细胞迁移抑制因子相互作用,初步探索巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞增殖存活的影响。方法:培养人胚胎干细胞,酶联免疫吸附实验检测细胞培养液中巨噬细胞迁移抑制因子水平,免疫荧光共聚焦显微镜观察巨噬细胞迁移抑制因子在细胞中的分布定位情况,细胞免疫荧光、免疫印迹方法检测胚胎干细胞中相关因子的表达;免疫荧光共聚焦显微镜、免疫共沉淀检测巨噬细胞迁移抑制因子与其受体的结合情况。分组干预:分别以巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1(0,12,24,48,96,192μmol/L)干预处理人胚胎干细胞24 h,确定最佳抑制浓度,然后将不同质量浓度巨噬细胞迁移抑制因子(30,100,300μg/L)与最佳抑制浓度ISO-1共孵育24 h。CCK-8法检测细胞增殖活性,TUNEL染色法检测细胞凋亡水平。结果与结论:①巨噬细胞迁移抑制因子在人胚胎干细胞的胞质、胞膜、培养基中均有表达;②人胚胎干细胞表达巨噬细胞迁移抑制因子,主要表达其受体CXCR2和CXCR7;③巨噬细胞迁移抑制因子主要结合受体CXCR7;④巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对细胞增殖存活的影响:与空白组相比,随着ISO-1浓度增大,细胞间隙明显增大,细胞活力逐渐降低(P<0.0001),TUNEL法检测细胞凋亡率明显增加(P<0.0001);⑤加入不同质量浓度的巨噬细胞迁移抑制因子(30,100,300μg/L)后,能减弱ISO-1(192μmol/L)诱导的细胞负相作用,细胞活性显著提高(P<0.05),细胞凋亡率明显降低(P<0.01);⑥结果表明,人胚胎干细胞表达分泌巨噬细胞迁移抑制因子这一重要因子,在胞质、胞膜、细胞外均可以检测到,人胚胎干细胞主要表达巨噬细胞迁移抑制因子的受体CXCR2和CXCR7,而不是经典受体CD74,在人胚胎干细胞上与巨噬细胞迁移抑制因子互作的蛋白受体是CXCR7,没有发现与CXCR2相互作用的证据,其作用还需进一步研究。另外,研究发现巨噬细胞迁移抑制因子对维持人胚胎干细胞的增殖存活发挥重要作用。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 干细胞 因子 巨噬细胞迁移抑制因子 细胞增殖 增殖
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巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞
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作者 郑晓晗 冯晓丽 +7 位作者 胡兰 高仕君 魏艳召 黄婷 孙圣童 魏绪芳 王埮 赵振强 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2023年第33期5348-5356,共9页
背景:细胞替代疗法是一种可以治疗帕金森病的非常有前景的方法。目前将人多能干细胞进行神经分化的主要方案是“双SMAD”抑制方案,利用阻断糖原合酶激酶3β来激活WNT通路信号,随后利用音猬因子信号与骨形态发生蛋白信号之间的调控相结合... 背景:细胞替代疗法是一种可以治疗帕金森病的非常有前景的方法。目前将人多能干细胞进行神经分化的主要方案是“双SMAD”抑制方案,利用阻断糖原合酶激酶3β来激活WNT通路信号,随后利用音猬因子信号与骨形态发生蛋白信号之间的调控相结合,可以精确地控制人多能干细胞从底板区域到顶板区域特异性的细胞命运。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类具有独特结构的多效免疫调节细胞因子,在多项研究中证明MIF对神经发育和分化非常重要。然而,MIF是否参与诱导干细胞的分化还是未知的。目的:在“双SMAD”抑制分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂(S,R)-3-(4-羟基苯基)-4,5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯(ISO-1),观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径。方法:CCK8检测添加不同浓度MIF和ISO-1培养人胚胎干细胞的存活情况。免疫荧光法检测人胚胎干细胞上MIF受体CD74、CD44、CXCR7的表达。在胚胎干细胞分化16 d后,通过RT-qPCR和Western blot分别检测腹侧中脑标志物LMX1A、FOXA2、EN1、前脑标记物FOXG1、后脑标记物HOXA2、中脑基板标记物PAX6和Wnt1/β-catenin信号通路转录因子SOX6的表达水平。同时,通过免疫荧光法检测LMX1A、FOXA2、EN1、MAP2的表达。将胚胎干细胞继续分化到42 d后用免疫荧光法检测LMX1A、FOXA2、TH和GIRK2在多巴胺能神经元中的表达。结果与结论:(1)MIF在人胚胎干细胞内表达,其相关受体CD44和CXCR7也表达,但CD74不发生表达;(2)添加MIF后,促进了LMX1、FOXA2、EN1的蛋白表达,促进了LMX1、FOXA2的基因表达,同时明显抑制了FOXG1和HOXA2以及PAX6的基因与蛋白表达,有效抑制了分化的异质性;(3)添加MIF后,多巴胺能神经祖细胞中SOX6并未如预期那样高表达,反而在基因层面表达下降,而其抑制剂ISO-1则使SOX6表达在基因水平上轻度升高;(4)该研究证明了MIF在人胚胎干细胞的多巴胺能分化潜能与腹侧中脑命运决定中起着重要作用,MIF的干预进一步优化了神经诱导的区域定位。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 巨噬细胞迁移抑制因子 帕金森病 多巴胺能神经祖细胞 分化
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人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞用于治疗兔角膜缘干细胞缺乏
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作者 杨哲 曾湘纹 +1 位作者 李钊 王丽强 《联勤军事医学》 CAS 2023年第7期553-558,共6页
目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞,观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法,将hES... 目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞,观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法,将hESCs H9细胞系向角膜上皮样细胞分化,将角膜上皮样细胞在去上皮羊膜片上培养构建重组细胞膜片。选取造模成功的12只LSCD兔,按照随机数表法分为对照组和实验组,对照组接受去上皮的的羊膜片治疗,实验组接受角膜上皮样细胞膜片移植治疗。术后通过裂隙灯、前节照相等方法,对角膜透明度、新生血管、荧光素钠染色情况进行评分,并于移植后4周观察角膜病理切片结构。结果 成功将hESCs诱导为角膜上皮样细胞,细胞形状和结构类似角膜上皮细胞。病理结果显示,实验组的角膜形成复层上皮结构,上皮下炎症细胞浸润轻,治疗效果明显优于对照组。进行细胞移植治疗后发现,实验组的角膜透明度高、新生血管少,角膜评分明显优于对照组(P<0.05)。诱导后的角膜上皮样细胞的角膜上皮标记物ΔNP63和CK12的表达与hESCs H9相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 采用拟胚体联合小分子化合物可以成功诱导出角膜上皮样细胞,角膜上皮样细胞膜片移植到兔体内后可有效治疗LSCD。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 角膜上皮样细胞 角膜缘干细胞缺乏 小分子化合物
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烯醇化酶1通过影响mRNA定位调节人胚胎干细胞自我更新能力
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作者 赫佳音 杨嘉宾 +2 位作者 陈仲扬 马艳妮 余佳 《基础医学与临床》 2023年第6期867-874,共8页
目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的... 目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的集落形成能力,荧光定量PCR检测hESCs的多能性及分化标志基因的表达变化,RNA荧光原位杂交技术检测带有polyA尾的RNA的定位变化。结果抑制ENO1的内源表达后,hESCs的集落形成能力得到了显著抑制(P<0.05),同时分化标志基因表达水平升高(P<0.001),带polyA尾的RNA的定位由分散在细胞质中变为集中在核内(P<0.001)。结论ENO1通过影响mRNA在细胞内的定位调控hESCs自我更新能力。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 烯醇化酶1 RNA结合蛋白 多能性 mRNA定位
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FAM60A在胚胎干细胞和肿瘤中的研究进展
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作者 席晓霞 张馨尹 +2 位作者 殷旭阳 程博 陈永林 《兰州大学学报（医学版）》 2023年第1期72-78,共7页
序列相似度60家族成员A (FAM60A)作为新型生物标志物受到广泛关注,本研究介绍了FAM60A在胚胎干细胞(ESCs)中作为SIN3转录调控蛋白家族成员A (SIN3A)复合体稳定性和功能完整性的关键蛋白,通过对细胞周期的调控,促进增殖并维持ESCs处于未... 序列相似度60家族成员A (FAM60A)作为新型生物标志物受到广泛关注,本研究介绍了FAM60A在胚胎干细胞(ESCs)中作为SIN3转录调控蛋白家族成员A (SIN3A)复合体稳定性和功能完整性的关键蛋白,通过对细胞周期的调控,促进增殖并维持ESCs处于未分化状态。分析了FAM60A在肿瘤发生发展中的重要作用,通过调控细胞周期和各种信号通路参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学过程,提出肿瘤发生与胚胎发育有关,但具体分子机制以及参与的相关信号通路有待深层次挖掘,为以后的研究提供新方向。 展开更多
关键词 序列相似度60家族成员A 胚胎干细胞 肿瘤 SIN3转录调控蛋白家族成员A/组蛋白去乙酰化酶复合体
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基于CRISPR/Cas9n技术建立携带mT-F2A-EGFP报告系统的小鼠胚胎干细胞系
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作者 王靖怡 王琼 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期417-427,共11页
目的·通过CRISPR/Cas9n(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nickase)介导的同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)技术在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell... 目的·通过CRISPR/Cas9n(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nickase)介导的同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)技术在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)的中内胚层关键调控分子T-box转录因子Brachyury(即T基因)末端依次敲入手足口病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A,F2A)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以建立T荧光报告细胞系(mTF2A-EGFP)。方法·首先,针对T基因构建特异性单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)质粒和包含F2A-EGFP的供体质粒。利用电穿孔将这2种质粒递送到mESC E14Tg2a(E14)内,通过HDR在T基因末端插入F2A-EGFP。然后,通过药物筛选和基因测序验证所获得的单克隆细胞,并将其诱导形成类胚体(embryonic body,EB)进行分化。通过荧光显微镜和流式细胞技术分别监测mT-F2A-EGFP细胞克隆在分化前后的荧光信号变化,并进行实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)来检测多能性标志基因、中内胚层以及外胚层标志基因的转录水平变化。同时,检测克隆细胞的周期、生长曲线,并利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色检测候选克隆干细胞特性。最后,挑选克隆细胞系T1进行了EB分化。利用流式细胞技术分选出分化细胞群中EGFP荧光表达细胞(EGFP+)和无荧光表达的细胞(EGFP-),并检测各谱系基因的表达情况。结果·EGFP被正确插入到E14细胞的T基因,其荧光强度能正确反映T基因表达水平且未产生明显的不良反应。当T1报告克隆分化时,通过流式细胞技术分选出的包含mT-F2A-EGFP的荧光细胞主要高表达中内胚层标志基因。结论·成功构建携带mT-F2A-EGFP的mESC,可实现对T基因调控程度的快速监测,并实时追踪分化过程中表达T基因标记EGFP的中内胚层细胞。 展开更多
关键词 小鼠胚胎干细胞 CRISPR/Cas9n 中内胚层分化 增强绿色荧光蛋白 报告基因 BRACHYURY 手足口病毒2A
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单倍体胚胎干细胞相关主题伦理审查问题探讨
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作者 李艳丽 王大鹏 《中国科技期刊数据库 科研》 2023年第4期0012-0016,共5页
人和动物单倍体胚胎干细胞技术的出现,为研究人类基因组功能以及发育机制提供了新的途径,未来可能在人类辅助生殖技术方面产生巨大的应用价值。但与此同时,该技术的出现也使得胚胎、胚胎干细胞与生殖细胞的界限越发模糊,给专利审查工作... 人和动物单倍体胚胎干细胞技术的出现,为研究人类基因组功能以及发育机制提供了新的途径,未来可能在人类辅助生殖技术方面产生巨大的应用价值。但与此同时,该技术的出现也使得胚胎、胚胎干细胞与生殖细胞的界限越发模糊,给专利审查工作带来了很大的挑战。本文从单倍体胚胎干细胞技术发展、面临的主要伦理争议、国际国内专利审查实践情况等几个方面,对单倍体胚胎干细胞相关专利主题是否涉及伦理问题等进行辨析,为我国相关专利主题的审查提供一定的参考。 展开更多
关键词 单倍体胚胎干细胞 单倍体胚胎 生殖细胞 社会公德
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增强定向造血分化信号提高人胚胎干细胞向自然杀伤细胞生成的效率
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作者 张朝晖 尹小凤 +7 位作者 徐博宁 毕清华 赖强强 季妍 刘涛 戴礼猛 刘高科 邓有才 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期839-846,共8页
目的探讨在造血分化阶段增强定向造血(DH)信号对人胚胎干细胞(hESCs)分化形成的自然杀伤(NK)细胞(也称为hESC-NK细胞)生成效率和功能的影响。方法hESC(H1)经离心法形成拟胚体,在诱导造血分化的第0至8天,对照组加入BMP4、VEGF、bFGF、SC... 目的探讨在造血分化阶段增强定向造血(DH)信号对人胚胎干细胞(hESCs)分化形成的自然杀伤(NK)细胞(也称为hESC-NK细胞)生成效率和功能的影响。方法hESC(H1)经离心法形成拟胚体,在诱导造血分化的第0至8天,对照组加入BMP4、VEGF、bFGF、SCF等细胞因子;而增强定向造血(DH)组在对照组的基础上添加WNT激动剂(CHIR99021)和Nodal-activin抑制剂(SB431542);进而采用一致的方法分化形成NK细胞。使用流式细胞术和靶细胞K562共培养等方法分析造血分化效率、NK细胞生成效率、体外效应功能及表面受体等相关分子表达。结果相较于对照组,DH组在造血分化阶段第8天动脉生血内皮细胞(CD34^(+)DLL4^(+))数量显著增加,原始造血相关细胞(CD34^(-)CD43^(+))显著降低(P<0.05)。在NK细胞分化第28天分析发现,DH组NK细胞(CD45^(+)CD56^(+))数量显著增加,效应功能相关分子IFN-γ、Granzyme B、Perforin、CD107a虽微弱上升,但无统计学差异,激活性受体CD16a和CD69明显增加,但NKP46显著降低,抑制性受体NKG2A显著增加,CD96显著降低(P<0.05)。结论在hESC向造血分化过程中增强定向造血信号,在不影响NK细胞体外功能的情况下显著提高NK细胞生成效率和CD16a表达,为提高hESC-NK细胞或iPSC-NK细胞生成效率提供了一种新的思路。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 自然杀伤细胞 定向造血 SB431542 CHIR99021
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胚胎干细胞试验在生殖毒性替代试验中的研究进展
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作者 马雪百合 陈文培 +2 位作者 郭健敏 张在平 杨威 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2023年第4期312-320,共9页
药物生殖毒性评估是药物安全性评价中必不可少的部分。传统生殖毒性试验周期长,动物使用量大,投入资金多,随着“减少、优化、替代(3R)”原则的实施,胚胎干细胞试验(EST)逐渐成为研究和应用的热点。EST是经欧洲替代方法验证中心验证并推... 药物生殖毒性评估是药物安全性评价中必不可少的部分。传统生殖毒性试验周期长,动物使用量大,投入资金多,随着“减少、优化、替代(3R)”原则的实施,胚胎干细胞试验(EST)逐渐成为研究和应用的热点。EST是经欧洲替代方法验证中心验证并推荐的生殖毒性全体外替代试验,可在药物研发早期阶段通过全体外检测和快速高通量检测药物的胚胎毒性类型。近年来,为解决EST在体外替代试验中遇到的问题,研究者们对其进行了优化和改进,包括增加化合物验证数量及种类,代谢体系及体内外浓度的选择,增加除心脏以外的分化检测终点(如神经、成骨和血管内皮等);增加定量检测方法,从基因和蛋白水平对分化情况进行分析(如流式细胞荧光分选技术等);增加EST衍生模型(如ReProGlo模型和BeWo运输模型等)以提高EST预测可靠性、模拟代谢活化过程、考虑体内外浓度一致性、对靶器官的毒性、增加定量分析终点。但目前有些检测方法还未明确其判断标准,有待进一步研究。EST更新及优化后,其评价范围不断扩大,风险评估准确性增加,有可能实现自动化、快速且高通量筛选潜在化合物。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 生殖毒性 替代试验
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L-抗坏血酸促进人胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究
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作者 陈景 邱敏 +3 位作者 张海鹏 李慧丽 张梦珍 李晓红 《生物医学工程与临床》 CAS 2023年第5期545-552,共8页
目的用不同浓度的L-抗坏血酸(VitC)作为分化基础培养液中的诱导剂,观察其对人胚胎干细胞(hESC)分化为心肌细胞的影响,探寻一种成分明确、成本低廉且高效的诱导方法。方法复苏hESC,使用干细胞培养液培养至细胞融合度90%后,分别用含不同浓... 目的用不同浓度的L-抗坏血酸(VitC)作为分化基础培养液中的诱导剂,观察其对人胚胎干细胞(hESC)分化为心肌细胞的影响,探寻一种成分明确、成本低廉且高效的诱导方法。方法复苏hESC,使用干细胞培养液培养至细胞融合度90%后,分别用含不同浓度(0、10、20、30、40、50、60、70μmol/L)VitC的分化培养液对其进行诱导分化,在光学显微镜下观察分化过程。用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)分别检测干细胞特异性标志物Nanog和性别决定因子同源盒2(Sox2),心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心脏特异性同源盒转录因子(Nkx2.5)的表达。用免疫荧光检测Nanog、cTnT、Nkx2.5的蛋白表达变化。结果在分化基础培养液中,低浓度VitC(10~30μmol/L)不能诱导h ESC向心肌分化,随着VitC浓度的增高,干细胞逐渐往心肌方向分化,心肌分化效率逐渐提高,Nanog和Sox2的表达量逐渐下降;VitC浓度为40μmol/L或50μmol/L组在第8天开始出现自发跳动细胞,且有cTnT和Nkx2.5阳性表达。realtime PCR结果显示随分化时间延长,cTnT和Nkx2.5的mRNA表达逐渐增加,心肌表面标志物Nkx2.5、cTnT的mRNA表达量在VitC浓度40μmol/L和50μmol/L要比60μmol/L和70μmol/L的诱导效果更高。提示浓度大于60μmol/L就开始出现抑制分化的作用。结论实验研究证实VitC在hESC向心肌分化中是不可或缺的因子,研究还明确了VitC诱导h ESC分化为心肌细胞的适宜浓度范围。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞(hESC) 心肌分化 心肌细胞 L-抗坏血酸(VitC) 维生素C
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科学家成功构建胚胎干细胞嵌合体猴
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作者 晓工 《科学》 CAS 2023年第6期10-10,共1页
[本刊讯]由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心刘真研究组、脑智卓越中心非人灵长类研究平台孙强研究团队和中国科学院广州生物医药与健康研究院M. A.Esteban研究组合作,首次成功构建... [本刊讯]由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心刘真研究组、脑智卓越中心非人灵长类研究平台孙强研究团队和中国科学院广州生物医药与健康研究院M. A.Esteban研究组合作,首次成功构建高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴,并证实猴胚胎干细胞可高效地贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。这对理解灵长类胚胎干细胞的全能性具重要意义,为遗传修饰模型猴的构建奠定了基础。成果以“高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴”为题,于2023年11月9日以封面文章形式发表在《细胞》(Cell)上。 展开更多
关键词 神经科学研究所 胚胎干细胞 中国科学院 嵌合体 封面文章 非人灵长类 胎盘组织 脑科学
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人孤雌胚胎干细胞与正常胚胎干细胞分化能力的比较 被引量：4
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作者 欧阳琦 林戈 +1 位作者 周晓樱 卢光琇 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期785-789,共5页
目的比较人类孤雌胚胎干细胞(pESCs)系与正常胚胎干细胞(nESCs)系的分化能力,探讨pESCs是否和nESCs一样具有多向分化潜能。方法将pESCs和nESCs分别注射到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内形成畸胎瘤,瘤体组织切片和HE染色后进行组织学分... 目的比较人类孤雌胚胎干细胞(pESCs)系与正常胚胎干细胞(nESCs)系的分化能力,探讨pESCs是否和nESCs一样具有多向分化潜能。方法将pESCs和nESCs分别注射到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内形成畸胎瘤,瘤体组织切片和HE染色后进行组织学分析;将pESCs和nESCs体外悬浮培养形成拟胚体(EB),利用RT-PCR检测3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;将pESCs和nESCs定向诱导分化为滋养层细胞,通过流式细胞仪测定人绒毛膜促性腺激素-β(hCG-β)阳性细胞比例以及通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行hCG-β的定量分析。结果在体内生长和体外培养过程中,pESCs和nESCs均能够向3个胚层的细胞类型分化。在SCID小鼠体内可形成畸胎瘤,有神经上皮、软骨、腺上皮等3个胚层的衍生物产生;pESCs和nESCs来源的EB在体外自发分化5～21d后,均检测到3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;pESCs定向分化为滋养细胞后,可以检测到hCG-β的表达,但其阳性细胞比例和分泌量均低于nESCs。结论 pESCs具有向3个胚层以及滋养层细胞分化的能力,但是向滋养层细胞分化的能力仍低于nESCs。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 孤雌胚胎干细胞 分化 细胞培养 人
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