脂肪组织特异性表达载体的构建

1

作者 华晓敏 许登高 潘庆杰 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2012年第2期84-88,共5页

采用PCR技术克隆了小鼠脂肪组织特异表达的脂肪酸结合蛋白ap2基因增强子和启动子,通过DNA重组技术将该基因增强子和启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-ap2重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组质粒进... 采用PCR技术克隆了小鼠脂肪组织特异表达的脂肪酸结合蛋白ap2基因增强子和启动子,通过DNA重组技术将该基因增强子和启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-ap2重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组质粒进行鉴定,并转染小鼠前脂肪细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度。结果表明,本实验克隆的ap2基因增强子和启动子的碱基组成与GenBank中的ap2基因序列完全一致,通过DNA重组技术将该基因增强子和启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,成功构建了脂肪组织特异表达的重组质粒。为以后的转基因动物的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 脂肪组织特异表达载体 增强子 启动子 ap2

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△~6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建 被引量：1

2

作者 冷虹 李加纳 +2 位作者 陆合 柴友荣 殷家明 《中国农学通报》 CSCD 2006年第4期66-70,共5页

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪... 以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。 展开更多

关键词 油菜 种子特异启动子 △^6-脂肪酸脱氢酶基因 植物表达载体

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动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究 被引量：11

3

作者 孙怀昌 陈刚 +2 位作者 张磊 宋红芹 施伟庆 《江苏农学院学报》 CSCD 2003年第4期1-4,共4页

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5’-、3’-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3。细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达... 为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5’-、3’-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3。细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达。将人激肽释放酶(hKLK1)cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异。结果表明:p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制。 展开更多

关键词 转基因动物乳腺生物反应器 特异表达载体 组织特异性 p205C3 细胞表达

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不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析 被引量：1

4

作者 蔡晓坤 林菊生 +2 位作者 刘址忠 薛秀兰 梁扩寰 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期33-36,共4页

　目的　分别构建巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV) 通用启动子和甲胎蛋白 (α fetoprotein, AFP) 组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法　将 AF0. 3 启动子插入载体 pcDNA3. 0,构建肝癌细胞特异表... 　目的　分别构建巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV) 通用启动子和甲胎蛋白 (α fetoprotein, AFP) 组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法　将 AF0. 3 启动子插入载体 pcDNA3. 0,构建肝癌细胞特异表达载体 pAF0 .3; 将 PNP基因分别插入到 pcDNA3 .0 和 pAF0. 3 中, 构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体 pcDNA3 .0/PNP和 pAF0. 3/PNP; 通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株, RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达, 分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中, CMV启动子调控下的 PNP基因在各株细胞中均实现了表达, 而 AF0 3 启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论　两 PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体, 且 pAF0. 3/PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。 展开更多

关键词 PNP 启动子 肝癌细胞 基因表达载体 调控 基因 PCDNA3 特异表达 组织特异性 重组体

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前列腺特异抗原(PSA)启动子组织特异性鉴定

5

作者 李玮 彭翠平 +4 位作者 刘贤锡 翟丽红 魏守水 迟伟玲 刘园园 《医学检验与临床》 2006年第2期45-47,共3页

目的构建前列腺特异的PGL3-LUC表达载体,观察报告基因的表达情况以验证其组织特异性。方法经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-psa转染前列腺癌细胞(Du-145)和... 目的构建前列腺特异的PGL3-LUC表达载体,观察报告基因的表达情况以验证其组织特异性。方法经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-psa转染前列腺癌细胞(Du-145)和肠癌细胞(HT-29),并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差。结果转染重组载体pGL3-psa诱导前列腺癌细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic和肠癌细胞的荧光素酶表达处于基础水平,比较差异有显著性意义P<0.05。结论构建的经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子的荧光素酶报告基因载体,转染前列腺癌细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有组织特异性。 展开更多

关键词 前列腺特异抗原 启动子 组织特异性 荧光素酶活性 前列腺癌细胞 重组载体 报告基因 转染 基因载体 荧光素酶检测 荧光素酶表达 系统检测 基础水平 过程误差 构建 改造 表达载体 比较差异 亚克隆 全序列

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骨骼肌细胞葡萄糖运载体4的研究进展 被引量：9

6

作者 林强 吴毅 胡永善 《中国康复医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期471-475,共5页

骨骼肌是体内最主要摄取葡萄糖和代谢葡萄糖的组织之一。葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的首要步骤。葡萄糖跨膜进入骨骼肌细胞需要细胞膜上的葡萄糖运载体（glucose transporter,GLUT）协助扩散。GLUT有多种亚型，其中葡萄糖运载体4... 骨骼肌是体内最主要摄取葡萄糖和代谢葡萄糖的组织之一。葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的首要步骤。葡萄糖跨膜进入骨骼肌细胞需要细胞膜上的葡萄糖运载体（glucose transporter,GLUT）协助扩散。GLUT有多种亚型，其中葡萄糖运载体4（GLUT4）是存在于骨骼肌、脂肪组织中帮助葡萄糖转运的蛋白。胰岛素和肌肉收缩可通过不同的机制调节GLUT4的基因表达和转位，从而促进葡萄糖的跨膜转运。因此，GLUT4是糖尿病基础研究中的一个热点。 展开更多

关键词 葡萄糖运载体4 骨骼肌细胞 GLUT4 跨膜转运 脂肪组织 葡萄糖转运 基因表达 肌肉收缩

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骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证 被引量：1

7

作者 于永生 张立春 +2 位作者 罗晓彤 刘铮 张树敏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期27-31,共5页

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-... 根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明其表达有效性。PCR扩增出1 815 bp的特异性片段,DNA测序结果证明该克隆片段与α-actin 5'端调控区序列相比具有很高的一致性,含有肌肉特异性元件;小鼠股四头肌注射重组载体,RT-PCR显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录。 展开更多

关键词 猪α-actin 线虫ω-3脂肪酸去饱和酶 肌肉特异表达载体 体外验证

原文传递

脂肪细胞因子的临床和基础研究 被引量：41

8

作者 宁光 杨军 +7 位作者 杨义生 张翼飞 顾卫琼 洪洁 李小英 陈名道 许曼音 陈家伦 《国外医学（内分泌学分册）》 2005年第3期158-160,共3页

脂肪组织具有旺盛的内分泌功能。其分泌的细胞因子可分为脂肪组织特异表达的脂肪因子如瘦素、脂联素和非特异表达的脂肪因子如多种炎症因子。近年新的脂肪因子不断被发现如内脏脂肪素等,同时已肯定脂肪因子参与体内多种代谢活动,尤其是... 脂肪组织具有旺盛的内分泌功能。其分泌的细胞因子可分为脂肪组织特异表达的脂肪因子如瘦素、脂联素和非特异表达的脂肪因子如多种炎症因子。近年新的脂肪因子不断被发现如内脏脂肪素等,同时已肯定脂肪因子参与体内多种代谢活动,尤其是与胰岛素抵抗的发生等密切相关。此外,脂肪因子的新的功能也不断被挖掘,其在体内的作用越来越重要。本文将结合本课题组对脂肪因子的临床和基础研究,介绍脂肪内分泌功能和脂肪因子作用等的进展。 展开更多

关键词 基础研究 脂肪细胞因子 临床 脂肪因子 内分泌功能 脂肪组织 特异表达 胰岛素抵抗 炎症因子 代谢活动 脂联素 脂肪素 课题组 多种 体内

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人胎盘碱性磷酸酯酶基因在鸡蛋蛋清中的表达

9

作者 刘影 陈立侨 +2 位作者 王维荣 闵太善 黄伟达 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期28-31,共4页

利用PCR方法从pSEAP2-control质粒中扩增获得人胎盘碱性磷酸酯酶基因plap的cDNA,将其克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)的卵清蛋白基因调控区下游。通过脂质体精子载体法人工授精母鸡,收集鸡蛋、孵化。雏鸡出壳后,抽提鸡冠基... 利用PCR方法从pSEAP2-control质粒中扩增获得人胎盘碱性磷酸酯酶基因plap的cDNA,将其克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)的卵清蛋白基因调控区下游。通过脂质体精子载体法人工授精母鸡,收集鸡蛋、孵化。雏鸡出壳后,抽提鸡冠基因组DNA,采用PCR方法检测两组孵化后代中的嵌合体鸡,第1组母鸡(95羽)中plap的PCR阳性检出率为75%,第2组母鸡(128羽)的阳性检出性率为81%。经Western blotting检测,仅1只嵌合体母鸡所产鸡蛋蛋清中检测到plap产物的存在。 展开更多

关键词 嵌合体鸡 输卵管组织特异表达载体 人胎盘碱性磷酸酯酶 表达

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骨骼肌特异表达载体的构建与验证

10

作者 于永生 曹阳 +1 位作者 罗晓彤 张树敏 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期14-17,共4页

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性。方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接... 目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性。方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT-PCR检测证明其表达有效性。结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT-PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。 展开更多

关键词 合成启动子 肌肉特异表达载体 - 3 脂肪酸去饱和酶 体外验证

原文传递

小鼠adiponectin的甲基化敏感性检测及其启动子克隆 被引量：1

11

作者 许登高 张敏 +1 位作者 曲贞晓 潘庆杰 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2013年第1期6-10,共5页

本试验通过对脂肪组织特异表达的脂肪因子adiponectin调控区域4个CpG位点在心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、腹脂、内脏脂肪中的甲基化程度以及adiponectin mRNA表达水平的检测,表明adiponectin在mRNA水平的表达与其调控位点的甲基化程度... 本试验通过对脂肪组织特异表达的脂肪因子adiponectin调控区域4个CpG位点在心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、腹脂、内脏脂肪中的甲基化程度以及adiponectin mRNA表达水平的检测,表明adiponectin在mRNA水平的表达与其调控位点的甲基化程度显著相关;同时采用PCR技术克隆了小鼠脂肪组织特异表达的脂联素的启动子,通过DNA重组技术将该基因的启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-P(adi)重组质粒,通过分子克隆测序方法对重组质粒进行鉴定,并转染小鼠前脂肪细胞,通过荧光素酶活性检测表明P(adi)具备驱动报告基因表达的活性,为今后制备转基因动物的研究奠定基础。 展开更多

关键词 脂肪组织特异表达载体 转基因动物 甲基化敏感型

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人脂联素cDNA的克隆及序列分析 被引量：5

12

作者 刘德敏 靳立忠 +1 位作者 孙颖 张捷 《天津医药》 CAS 北大核心 2005年第2期71-73,共3页

目的:构建人脂联素cDNA的克隆并进行序列分析。方法:提取人脂肪组织总RNA,运用RT-PCR方法扩增人脂联素cDNA完全编码区,将扩增产物通过TA克隆技术克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行测序验证。结果:成功构建人脂联素cDNA的克隆,重组质粒(p... 目的:构建人脂联素cDNA的克隆并进行序列分析。方法:提取人脂肪组织总RNA,运用RT-PCR方法扩增人脂联素cDNA完全编码区,将扩增产物通过TA克隆技术克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行测序验证。结果:成功构建人脂联素cDNA的克隆,重组质粒(pMD18-T/ADPN)经测序与Genebank检索的脂联素cDNA序列进行对比证实为100%同源。结论:所构建的人脂联素cDNA克隆适于进一步的克隆表达。 展开更多

关键词 脂联素 CDNA序列 克隆表达 重组质粒 序列分析 测序 脂肪组织 T载体 克隆技术 CDNA克隆

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脂滴相关蛋白周脂素的研究进展 被引量：2

13

作者 乔洁 陈名道 《国外医学（内分泌学分册）》 2005年第3期195-197,共3页

周脂素(Perilipin)是包被于脂滴表面的一种磷蛋白,特异表达于脂肪细胞和类固醇生成细胞中,对脂肪分解具有双重调节作用,可以调控脂解率以及脂肪组织中甘油三酯的输出。基础状态下,周脂素作为脂肪酶的屏障抑制脂解。在能量需求增加的情况... 周脂素(Perilipin)是包被于脂滴表面的一种磷蛋白,特异表达于脂肪细胞和类固醇生成细胞中,对脂肪分解具有双重调节作用,可以调控脂解率以及脂肪组织中甘油三酯的输出。基础状态下,周脂素作为脂肪酶的屏障抑制脂解。在能量需求增加的情况下,脂解调节激素儿茶酚胺通过cAMP依赖性蛋白激酶A,使周脂素中丝氨酸磷酸化,促进激素敏感性脂肪酶转位至脂滴表面而促进脂解。周脂素基因受过氧化物酶体增殖物激活受体的调控,可能与肥胖的发生、体脂分布异常和胰岛素抵抗有关。 展开更多

关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体 相关蛋白 脂滴 体脂分布异常 蛋白激酶A 激素敏感性 胰岛素抵抗 生成细胞 脂肪细胞 特异表达 调节作用 脂肪分解 甘油三酯 脂肪组织 基础状态 能量需求 cAMP 儿茶酚胺 调节激素 脂肪酶 脂解

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抵抗素与糖脂代谢

14

作者 马晓梅 杨杰 《西藏医药》 2012年第3期39-40,共2页

抵抗素(resistin)是近年来新发现的一个由脂肪组织特异表达分泌的细胞因子,众多的研究显示抵抗素在调节糖代谢中具有一定作用。对抵抗素的表达、作用机制及生物学功能的深入研究,有助于进一步阐明肥胖、代谢综合征及糖尿病等的发病机制... 抵抗素(resistin)是近年来新发现的一个由脂肪组织特异表达分泌的细胞因子,众多的研究显示抵抗素在调节糖代谢中具有一定作用。对抵抗素的表达、作用机制及生物学功能的深入研究,有助于进一步阐明肥胖、代谢综合征及糖尿病等的发病机制,从而为这些疾病的治疗提供新的方向。1抵抗素2001年,Steppan[1]等在研究TZDs调节脂肪分化的基因时发现了一种新的脂肪因子。 展开更多

关键词 糖脂代谢 抗胰岛素 脂肪细胞 型糖尿病 代谢综合征 胰岛素抵抗 细胞因子 生物学功能 糖代谢 组织特异表达

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携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究 被引量：15

15

作者 刘毅 薛美思 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期822-827,共6页

目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工... 目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到293T细胞内包装病毒,荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(multiple of infection,MOI,分别为0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测细胞中insulin基因及insulin蛋白水平的表达情况。结果成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/mL。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%。实时荧光定量PCR检测示转染组insulin mRNA表达阳性,未转染组为阴性;Western blot检测示转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs,表达insulin蛋白。 展开更多

关键词 组织工程脂肪 人脐带间充质干细胞 胰岛素 绿色荧光蛋白 基因转染 慢病毒表达载体

原文传递