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5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立
1
作者 吴静波 南文金 +2 位作者 胡鸿惠 黄健强 彭国良 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第3期18-26,共9页
猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧... 猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10^(1)~1×10^(9),批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%~100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所建立的荧光定量PCR方法灵敏、特异、稳定,能够同时、快速区分检测上述5种猪源消化道传播病原体,可为猪肉制品从产地到餐桌全环节样品的监测提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 猪 人兽共患病 消化道传播 荧光定量pcr
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牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
2
作者 蒲鹏 李晨露 +2 位作者 张琪 吴发兴 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期7-10,共4页
为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan... 为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 TaqMan荧光定量pcr 检测方法
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猪丹毒丝菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立
3
作者 陈超 高春阳 +5 位作者 刘刚 姜志康 柳宇 张雪莲 袁生 韩先杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期337-343,共7页
为建立一种快速、 敏感的猪丹毒丝菌检测方法, 本试验将猪丹毒丝菌的 grol 基因与载体TA/ Blunt- Zero 相结合构建重组质粒,以该重组质粒 DNA 为模板,筛选最佳反应条件,建 立 SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 检测方法,并对该方法进行灵敏度... 为建立一种快速、 敏感的猪丹毒丝菌检测方法, 本试验将猪丹毒丝菌的 grol 基因与载体TA/ Blunt- Zero 相结合构建重组质粒,以该重组质粒 DNA 为模板,筛选最佳反应条件,建 立 SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 检测方法,并对该方法进行灵敏度、特异性和重复性测定。 结果表明,本研究建立的检测方法对在 2×10^(2)~2×10^(9)copies/ μL 浓度范围内的质粒标准品有良好的线性关系, 线性相关系数 R^(2)=0.999 5,标准曲线为 y=-3.231x+41.834,未见非特异性扩增。 该方法对质粒标准品最低检测浓度为 20 copies/ μL,敏感度比普通 PCR 提高了 1 000 倍。 用该方法检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、猪链球菌 3 型(Ss3)、猪链球菌 2型(Ss2)、大肠杆菌(E.coli)、沙门菌(Salmonella)和多杀性巴氏杆菌(Pm)时,检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。重复试验结果显示,组内和组间的变异系数均小于 2%,表明该方法具有良好的重复性。运用本试验建立的方法对 20 株疑似猪丹毒丝菌临床样品进行检测,阳性检出率为 60%,高于普通 PCR 检出率(50%)。 综上,本试验建立的检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,适合临床上快速诊断丹毒丝菌。 展开更多
关键词 猪丹毒丝菌 grol基因 SYBR GreenⅠ荧光定量pcr 检测方法
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荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用效果
4
作者 梁罕超 朱素优 +2 位作者 曾丽锦 许冠杰 赖其飞 《中国当代医药》 2024年第1期59-63,共5页
目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR... 目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR技术检查。以染色体核型分析为标准,分析QF-PCR技术在产前诊断中的应用价值。结果388例受检羊水中,QF-PCR检测出其中1例母血污染。388例受检者中QF-PCR共检出17例染色体非整倍体异常,包括21三体异常10例,18三体异常2例,13三体异常1例,性染色体异常4例。与染色体核型分析结果相符,染色体核型分析结构异常13例,QF-PCR技术均未检出。结论QF-PCR技术能鉴别母血污染以及检查快速,可弥补染色体核型分析时间长的不足;而染色体核型分析可补充QF-PCR技术对其他染色体异常检测的不足,两种方法联合使用可起互补作用,利于减少出生缺陷。 展开更多
关键词 非整倍体 荧光定量pcr 染色体核型分析 产前诊断 母血污染
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荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究
5
作者 张东浩 《中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生》 2024年第3期0185-0188,共4页
探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定... 探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。 展开更多
关键词 结核病 结核分枝杆菌 耐药基因检测 荧光定量pcr探针熔解曲线法 应用价值
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牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用
6
作者 刘存 刘孟超 +6 位作者 张月 王晓玲 赵梦姣 李云岗 兰邹然 孙圣福 刘砚涵 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期146-150,共5页
为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×1... 为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 荧光定量pcr Gpcr基因 诊断
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猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立
7
作者 董苏洁 孔宁 +9 位作者 秦文珍 翟焕杰 翟雪滢 杨心雨 童武 郑浩 于海 童光志 李有文 单同领 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期174-180,共7页
为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。... 为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 SYBR Green I 荧光定量pcr
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猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
8
作者 杨奕 吴发兴 +4 位作者 康京丽 孙洪涛 王志亮 许信刚 张琪 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期75-79,共5页
旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的P... 旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2 TAQMAN探针 荧光定量pcr
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实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用
9
作者 杨挺懿 杨婧 +7 位作者 黄欣梅 韩凯凯 赵冬敏 章丽娇 刘宇卓 李银 张小飞 刘青涛 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期104-109,共6页
为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重... 为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。 展开更多
关键词 鸭源鹅细小病毒 实时荧光定量pcr 排毒
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美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
10
作者 孔文迪 陈曦 +1 位作者 杨金先 葛均青 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期358-365,共8页
为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出... 为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。 展开更多
关键词 美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV) 普通pcr 荧光定量pcr SYBR GreenⅠ 检测方法
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鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立
11
作者 孙宇 苗立中 +6 位作者 程立坤 赵家磊 赵修报 沈志强 王敬茹 李书光 余燕 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期64-68,共5页
为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准... 为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 Taq Man探针 荧光定量pcr
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水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
12
作者 盛陈艳 麻宝艺 +7 位作者 李健明 宫庆龙 刘菲 时坤 孙志博 刘艺 冷雪 杜锐 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期131-138,共8页
为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关... 为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 水貂圆环病毒 Cap基因 SYBR Green II实时荧光定量pcr方法
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绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选
13
作者 张敏 李子鹏 +2 位作者 赵欣然 张仙红 郑海霞 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期174-183,共10页
绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献... 绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。 展开更多
关键词 绿豆象 实时荧光定量pcr 内参基因 不同发育阶段 组织 基因稳定表达
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荧光定量PCR法鉴别蛤蚧定喘丸中醋鳖甲
14
作者 韩婧 陈香 +4 位作者 李叶 沈玉萍 孙小祥 夏国华 杨欢 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1209-1213,共5页
目的建立蛤蚧定喘丸中醋鳖甲的DNA分子鉴定方法。方法根据鳖、佛罗里达鳖线粒体基因序列的差异设计特异性引物TS和AF,进行荧光定量PCR和方法学考察,然后对市售蛤蚧定喘丸中醋鳖甲进行鉴定。结果含有鳖、佛罗里达鳖的DNA样品仅与相应引... 目的建立蛤蚧定喘丸中醋鳖甲的DNA分子鉴定方法。方法根据鳖、佛罗里达鳖线粒体基因序列的差异设计特异性引物TS和AF,进行荧光定量PCR和方法学考察,然后对市售蛤蚧定喘丸中醋鳖甲进行鉴定。结果含有鳖、佛罗里达鳖的DNA样品仅与相应引物扩增后可检测到荧光信号,有特定温度单一峰,T_(m)分别为77.45、79.72℃。该方法的检测限为10 copies/μL,重复性较高(CV<1%)。10批蛤蚧定喘丸中有9批仅检出鳖DNA,被鉴定为正品;1批同时检出鳖DNA和佛罗里达鳖DNA,被鉴定为掺伪品。结论本研究所建立的方法可快速、可靠地鉴定蛤蚧定喘丸中醋鳖甲炮制品成分,有助于监管含醋鳖甲成方制剂的质量,并为成方制剂中动物药成分的专属性鉴定研究提供新途径。 展开更多
关键词 蛤蚧定喘丸 醋鳖甲 特异性引物 荧光定量pcr
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检测PRRSV及鉴别HP-PRRSV毒株的二重PCR与二重TaqMan荧光定量PCR方法
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作者 陈旭 汤德元 +6 位作者 曾智勇 王彬 袁盛林 廖正波 何松 周飘 毛茵茗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期316-324,共9页
为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M... 为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M基因和HP-PRRSV Nsp2基因设计特异性引物和探针,优化反应条件建立二重TaqMan荧光定量PCR方法,并评估这2种方法的敏感性、特异性、重复性。敏感性试验结果显示:二重PCR方法的检测下限分别为0.058 ng/μL(PRRSV)和4.7 ng/μL(HP-PRRSV);二重TaqMan荧光PCR方法的检测下限分别为10 copies/μL(PRRSV)和100 copies/μL(HP-PRRSV)。这2种方法与其他猪病病原均不发生非特异性反应,重复性试验结果良好。经131份临床样品检测,可得到PRRSV的阳性率约12.2%(16/131)、HP-PRRSV的阳性率约17.6%(23/131)、二者的混合感染率约8.4%(11/131)。证实,本研究成功建立了二重PCR和二重TaqMan荧光定量PCR检测方法,可为临床上猪繁殖与呼吸综合征的防控提供技术支持。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重pcr 二重TaqMan荧光定量pcr 鉴别检测
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猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立
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作者 郭存杰 王蕾 +3 位作者 毕振威 钱晶 张传美 谭业平 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期91-95,共5页
为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏... 为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。 展开更多
关键词 猫冠状病毒 猫细小病毒 双重荧光定量pcr
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氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证
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作者 李庆会 李睿 +3 位作者 温晓菊 倪德江 王明乐 陈玉琼 《茶叶科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期27-36,共10页
为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,... 为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,分析氟胁迫条件下(0.42 mmol·L^(-1)NaF)8个候选内参基因(CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC)在茶树不同叶位(新梢和老叶)、不同胁迫时间(0、1、3、7 d)的表达稳定性。结果显示,在氟胁迫条件下,茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN,老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因(CsFEX)的表达情况,发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致,说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。 展开更多
关键词 茶树 氟 内参基因 实时荧光定量pcr 基因表达
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猫冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 陈秋阳 梁瑞英 +3 位作者 梁琳 汤新明 秦彤 丁家波 《动物医学进展》 北大核心 2024年第3期16-21,共6页
猫冠状病毒(FCoV)在全球猫种群中广泛流行,隐形感染的猫导致病毒在猫群中持续传播。提高样本检测率、早预防、早治疗可减少种群中病毒流行率。为建立可以灵敏、准确检测FCoV的Taq Man荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的FCoV基因片段... 猫冠状病毒(FCoV)在全球猫种群中广泛流行,隐形感染的猫导致病毒在猫群中持续传播。提高样本检测率、早预防、早治疗可减少种群中病毒流行率。为建立可以灵敏、准确检测FCoV的Taq Man荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的FCoV基因片段N保守区域设计了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应体系,建立了FCoV Taq Man荧光定量PCR检测方法,对75份临床样品进行检测。结果表明,该方法在1.49×10^(11)~1.49×10^(2) copies/μL之间具有良好的线性关系,特异性强,敏感性高,对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(0) copies/μL,而普通PCR对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(5) copies/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;75份临床样品,阳性率为37.33%。研究建立的FCoV检测方法扩增效率高、特异性强、敏感性好、稳定性高,且实用性好,可以用于FCoV的快速检测,可为流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多
关键词 猫冠状病毒 荧光定量pcr Taq Man探针
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N1亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 张傲 王佳慧 +2 位作者 王文佳 谭斌 张淑琴 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期157-161,共5页
为建立一种灵敏准确检测N1亚型猪流感病毒(SIV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法,本研究靶向N1亚型SIV NA基因的保守区设计特异性引物并构建质粒标准品,通过优化反应条件建立real-time PCR检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估... 为建立一种灵敏准确检测N1亚型猪流感病毒(SIV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法,本研究靶向N1亚型SIV NA基因的保守区设计特异性引物并构建质粒标准品,通过优化反应条件建立real-time PCR检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估,与常规PCR方法进行对比并应用于临床检测。结果显示,优化后所建方法的标准曲线为y=-3.329 7x+36.881,R^(2)=0.999 5,E=99.6%,质粒标准品的拷贝数与C_(t)值具有良好的线性关系。该方法特异性良好,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无交叉反应。最低检测量为1.03×10^(1)copies/μL,灵敏度为常规PCR的100倍。重复性试验结果显示,组内与组间的变异系数均小于3.0%。所建方法对临床样品的检出率与鸡胚分离检测结果具有较高的符合率。上述结果表明,所建方法灵敏度高且特异性强,可应用于N1亚型SIV的临床样品检测与鉴定。 展开更多
关键词 猪流感病毒 N1亚型 实时荧光定量pcr 鉴别诊断
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鸡圆圈病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立与应用
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作者 牛群 庄丽云 +5 位作者 雷天宇 戴婷婷 孟庆福 刘荣昌 何华 郑新添 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期56-62,共7页
本研究针对圆圈病毒3型(GyV3)VP2基因构建标准质粒,以此作为模板建立标准曲线,在优化qPCR反应体系的基础上,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示,该方法仅对GyV3特异性扩增,最低检测模板浓度为1.585×10^(1)copies/... 本研究针对圆圈病毒3型(GyV3)VP2基因构建标准质粒,以此作为模板建立标准曲线,在优化qPCR反应体系的基础上,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示,该方法仅对GyV3特异性扩增,最低检测模板浓度为1.585×10^(1)copies/μL,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.0%。用本研究建立的qPCR方法对50份临床样品进行检测,阳性检出率为10%(5/50),高于常规PCR的阳性检出率8%(4/50)。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好、灵敏度高,可用于临床快速检测GyV3。 展开更多
关键词 圆圈病毒3型 VP2基因 实时荧光定量pcr
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