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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1
作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-pcr方法
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帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
2
作者 杨恒 李占鸿 +5 位作者 宋子昂 高林 李卓然 廖德芳 肖雷 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期395-400,共6页
本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,... 本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。 展开更多
关键词 帕利亚姆病毒 血清型鉴定 实时荧光定量rt-pcr 检测方法
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猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
3
作者 柳佳佳 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 叶泥 边孟婷 黄书 田红利 潘向英 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期162-168,共7页
根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标... 根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 TAQMAN探针 荧光定量rt-pcr
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马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
4
作者 梁歆歆 王科珂 +6 位作者 蒋刚强 徐军 陈凯云 王艳 肖媛媛 白梅花 刘东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期159-163,共5页
为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的... 为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。 展开更多
关键词 马病毒性动脉炎 ORF7基因 荧光定量rt-pcr
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H3亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
5
作者 毛秋艳 周淑宁 +9 位作者 刘朔 彭程 尹馨 张雅馨 周婉婷 李金平 侯广宇 蒋文明 宋厚辉 刘华雷 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1137-1146,共10页
H3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的H3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近... H3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的H3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近年来公开的H3亚型AIV HA基因序列,在保守区域设计一对特异性引物和Taq Man探针。通过对反应条件的优化,分别以cRNA阳性标准品和病毒核酸标准品为模板绘制标准曲线,建立了针对H3亚型AIV的荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性进行评估。进一步使用实验室攻毒鸡组织样品和临床拭子样品对该方法进行了验证。结果表明,该方法特异性强,与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应;检测下限分别为1.0×10^(2) copies·μL^(-1)和10^(2) EID 50·0.1 mL^(-1),灵敏度与常规RT-PCR相比提高了10倍;组内和组间变异系数均小于1.5%,重复性较好。动物攻毒临床试验样品和临床拭子样品检测结果显示,该检测方法敏感性高于普通RT-PCR方法,与病毒分离鉴定结果一致,符合率为100%,可用于临床检测。综上,本研究建立的H3亚型AIV荧光定量RT-PCR检测方法具备特异、快速、灵敏等特点,为H3亚型AIV的快速诊断和监测及防控提供一定的技术支持。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H3亚型 荧光定量 监测
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猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
6
作者 孙彦婷 康宇 +5 位作者 路亚男 井汇源 董望 李向辉 王金合 唐光武 《现代牧业》 2023年第3期12-17,共6页
建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.1... 建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 M基因 荧光定量rt-pcr TAQMAN
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猪腹泻病毒一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法的建立及应用 被引量：2
7
作者 王一丹 杨发龙 +2 位作者 陈弟诗 向华 任玉鹏 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期179-192,共14页
【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊... 【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析,以PEDV野毒株为模板,对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针,并在两端保守区域设计上下游引物;在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针,并加入简并碱基。同时,分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针,用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化;用RStudio参照代码绘制ROC曲线,确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC,并计算Youden指数,最终确定检测临界值;从阳性核酸中扩增靶基因,并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录,获得5种标准品分别命名为:cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估;并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为:35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×10^(2) copies/μL,标准曲线线性关系良好,扩增效率在96.3%-104%之间;该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和葡萄球菌(S.aureus)等多种菌毒株均不检出,具有良好的特异性;经重复性检验,组内变异系数在0.22%-3.08%之间,组间变异系数在0.89%-4.0%之间;对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较,符合率分别为:PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外,对临床样本检测结果显示,当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出;但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行,其总体阳性率分别达到:10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242),且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染,使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究,为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR,为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。 展开更多
关键词 一步法多重TaqMan荧光定量rt-pcr 猪腹泻相关病毒 鉴别诊断 检测临界值
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鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
8
作者 王宏宇 朱寅初 +2 位作者 云涛 张存 鲍恩东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1616-1623,共8页
鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAst... 鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。 展开更多
关键词 鹅星状病毒Ⅰ型 鹅星状病毒Ⅱ型 双重荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
9
作者 赵润涛 特木尔巴根 +7 位作者 郭宇 武娅楠 王旭芬 侯琳 张贺 赵洋 张志丹 周伟光 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期851-856,共6页
【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法... 【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。 展开更多
关键词 牛嵴病毒 荧光定量rt-pcr 犊牛腹泻 特异性 敏感性 重复性
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基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
10
作者 魏新宇 王铭 +3 位作者 杜炳辰 史智宾 杨德成 王靖飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期910-915,929,共7页
为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经... 为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-nsP3作为模板,利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通RT-PCR的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。 展开更多
关键词 盖他病毒 荧光定量rt-pcr nsP3 检测方法
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番茄褐色皱果病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
11
作者 李献锋 于璇 +7 位作者 冯黎霞 于翠 丁钿 徐强 赵菊鹏 马骏 武目涛 魏霜 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期185-193,共9页
为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并... 为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R^(2)为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的Taq Man荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。 展开更多
关键词 番茄褐色皱果病毒 RNA依赖的RNA聚合酶 Taq Man探针 荧光定量rt-pcr 检测
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犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 徐航 任建炜 +2 位作者 于德涛 曹志 温建新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期379-384,共6页
为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV ... 为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 犬冠状病毒 双重荧光定量rt-pcr
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猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈林文 冀伟 +5 位作者 曹龙龙 王莹 李秋燕 曹胜波 陈清秀 周登元 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1141-1147,1198,共8页
为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原... 为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原的目的基因并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1,并均经PCR和测序鉴定。将3种重组质粒标准品稀释到同一浓度1×10^(8)拷贝/μL,按体积比1∶1∶1混合后作为模板,采用方阵法优化各反应条件后,建立了检测上述病原的三重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。以FPV、FCV、FHV-1、猫博卡病毒、猫冠状病毒、猫支原体、猫白血病病毒、猫星状病毒的基因组为模板采用本研究建立的方法检测,评估该方法的特异性,结果显示,该方法仅能检测到FPV、FCV、FHV-1,而其他病原的检测结果均为阴性。选取1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(6)拷贝/μL的混合质粒标准品和10^(-0.5) TCID_(50)/mL~10^(5.5) TCID_(50)/mL的混合病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法检测重组质粒和病毒的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1的检测限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,对3种病毒的检测限均约为10^(0.5) TCID_(50)/mL;以1×10^(7)拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10^(3)拷贝/μL质粒标准品混合物作为模板分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于3%。利用建立的该三重荧光定量RT-PCR和常规PCR对81份临床样品(77份猫的眼、鼻、咽、肛混合拭子样品和4份组织病料样品)分别检测,结果显示三重荧光定量RT-PCR检测出47份FPV、13份FCV和13份FHV-1阳性样品,而常规PCR分别检测出39份FPV、9份FCV和6份FHV-1阳性样品,该三重荧光定量RT-PCR与FPV、FCV、FHV-1常规PCR的总符合率分别为90.12%、95.06%、92.59%。本研究建立的三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为FPV、FCV、FHV-1临床样品的快速鉴别检测提供了有力技术支持。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒 猫杯状病毒 猫疱疹病毒1型 三重荧光定量rt-pcr
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：1
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作者 黎家明 郑烁东 +5 位作者 罗世诚 张浩权 颜广智 陈盛楠 刘明杰 黄良宗 《广东畜牧兽医科技》 2023年第1期24-28,62,共6页
为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床... 为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 TAQMAN 荧光定量rt-pcr
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BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 周思佳 韩佃刚 +5 位作者 董俊 杨云庆 叶玲玲 李静 张冲 信吉阁 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第3期423-430,共8页
【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性... 【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1) 实时荧光定量rt-pcr 病毒检测
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传染性胰脏坏死病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 张文 徐立蒲 +5 位作者 吕晓楠 王小亮 曹欢 王姝 王静波 王澎 《中国动物检疫》 CAS 2023年第4期106-113,共8页
传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一种严重危害鲑鳟鱼类的重要传染性病原。为建立IPNV快速检测方法,根据IPNV VP2蛋白编码基因保守序列,设计并筛选出特异性引物和Taq Man探针,并优化筛选引物以及探针... 传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一种严重危害鲑鳟鱼类的重要传染性病原。为建立IPNV快速检测方法,根据IPNV VP2蛋白编码基因保守序列,设计并筛选出特异性引物和Taq Man探针,并优化筛选引物以及探针检测浓度、退火温度和退火时间,建立了一种实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法进行了评价。结果显示:该方法灵敏度高,对IPNV的检测限为5 copies/μL;特异性强,对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒等其他病毒核酸扩增均呈阴性;重复性良好,组内与组间重复平均变异系数均小于3%;用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法,对40份经病毒分离鉴定的样品进行IPNV检测,符合率为100%。结果表明,本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可检测病毒含量较低的组织样品,对于IPNV的快速检测更具优势。 展开更多
关键词 传染性胰脏坏死病毒 实时荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 王宏燕 方方 +10 位作者 杨作丰 董娜 赵方圆 巩玉洁 赵荣茂 朱丽君 严鑫莹 崔雨葳 王连山 刘晓明 姜斌 《养猪》 2023年第6期58-61,共4页
本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特... 本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 双重荧光定量rt-pcr
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一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量RT-PCR检测方法及其应用
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作者 储旭 房文红 +3 位作者 刘志强 周俊芳 李信书 李新苍 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2023年第5期172-181,共10页
青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一,青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业的高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播,本研究研发了一种筛选无M... 青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一,青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业的高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播,本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度地提高检测灵敏性,首先,本研究分析MCRV在感染青蟹主要组织中的含量,发现血淋巴中病毒载量最高;随后,分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平,发现病毒VP11基因相对表达量最高;最后,基于VP11基因序列保守区设计特异引物,建立了一种SYBR Green quantitative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测方法,该方法可精确检测的病毒下限为50 copies/反应。该检测方法具有组织和靶标基因选择优势,灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测,均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约50μL/只)提取RNA,随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测,阳性率分别54.44%和85.00%。此外,利用该方法进一步分析了MCRV在较低温度下(21℃)在青蟹体内的增殖情况,发现病毒感染早期MCRV呈指数方式增殖,随后进入平台期,实验周期内无青蟹死亡。总之,本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法,既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选,也能满足病原感染相关研究的需要。 展开更多
关键词 MCRV 检测方法 青蟹种蟹 定量rt-pcr
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塞内卡病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 周霞 温肖会 +9 位作者 赵亮 翟颀 吕殿红 罗胜军 贾春玲 周秀蓉 牛佳伟 陈天宝 贺东生 翟少伦 《动物医学进展》 北大核心 2023年第6期1-6,共6页
为加强塞内卡病毒(SVA)在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据GenBank中发表的SVA VP1基因区域设计一对特异性引物和带有TaqMan发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量RT-PCR方法的模板,对反应体系和条件进行... 为加强塞内卡病毒(SVA)在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据GenBank中发表的SVA VP1基因区域设计一对特异性引物和带有TaqMan发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量RT-PCR方法的模板,对反应体系和条件进行优化,构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法的最适退火温度为55℃,最佳引物和探针浓度分别为0.2μmol/L和0.4μmol/L,最佳反应循环数为45,Ct值与标准品浓度的对数线性关系好。对猪源、鼠源及牛源SVA和其他动物病毒(O型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、D型流感病毒、蓝舌病毒)的核酸检测结果显示,除猪源、鼠源及牛源SVA为阳性外,其他病毒核酸为阴性。该方法最低检测限为2.66×10~1拷贝/μL,重复试验中组内和组间变异系数均小于0.1%。建立的检测多宿主SVA TaqMan RT-qPCR方法具有良好的特异性和稳定性,为SVA在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 探针 实时荧光定量PCR 检测
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微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的比较
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作者 杨飞 《中华卫生杀虫药械》 CAS 2022年第1期64-67,共4页
目的比较微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的情况。方法以汉城病毒(Seoul virus,SEOV)和汗滩病毒(Hantaan virus,HTNV)作为靶序列设计特异性的引物探针,制备体外转录RNA参考品,对其灵敏性进行评价,通过S... 目的比较微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的情况。方法以汉城病毒(Seoul virus,SEOV)和汗滩病毒(Hantaan virus,HTNV)作为靶序列设计特异性的引物探针,制备体外转录RNA参考品,对其灵敏性进行评价,通过SEOV和HTNV的假病毒或者病毒培养物制备模拟阳性样本,分别通过微流控和荧光定量RT-PCR检测。结果SEOV、HTNV体外转录RNA参考品拷贝数浓度分别是2.54×10^(12)、1.26×10^(12)copies/μl。SEOV、HTNV微流控实时荧光定量RT-PCR检测最低检出限值分别是119.5、123.8 copies/PCR,实时荧光定量RT-PCR检测分别是120.4、128.9 copies/PCR。两种方法检测不同浓度SEOV、HTNV的变异系数均<2%,检出率均为100%。结论微流控实时荧光定量RT-PCR检测具有很好的特异性、稳定性和灵敏性,适用于现场实验室检测。 展开更多
关键词 出血热病毒 微流控实时荧光定量rt-pcr 实时荧光定量rt-pcr
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