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葎草花粉变应原Humj1的重组表达、纯化及鉴定
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作者 尹希瑶 谷新雨 +2 位作者 李忠波 王坚 冀伟 《长春理工大学学报(自然科学版)》 2024年第4期101-106,共6页
通过载体构建、原核表达和纯化葎草花粉主要变应原Humj1,获得具有免疫活性的葎草变应原Humj1重组蛋白。经密码子优化,合成葎草Humj1基因,设计含有酶切位点的引物,将PCR扩增产物与pGEM-T载体连接,构建克隆载体,获得的目的片段与pET-28a... 通过载体构建、原核表达和纯化葎草花粉主要变应原Humj1,获得具有免疫活性的葎草变应原Humj1重组蛋白。经密码子优化,合成葎草Humj1基因,设计含有酶切位点的引物,将PCR扩增产物与pGEM-T载体连接,构建克隆载体,获得的目的片段与pET-28a表达载体连接,成功构建了pET-28a-Humj1原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21宿主菌中得到高效表达,并通过Ni-NTA亲和层析法纯化获得融合蛋白。对表达蛋白的生物信息学分析,测定其为亲水性蛋白,有较强的抗原性,主要以无规则卷曲结构为主。采用Western blotting免疫印迹法研究证明重组蛋白能与葎草花粉过敏患者血清结合,具有免疫活性,对将来研制葎草抗原的单克隆抗体以及脱敏疫苗的制备具有重要的临床意义。 展开更多
关键词 葎草花粉变应原 原核表达 蛋白纯化 免疫印迹
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葎草花粉变应原核酸疫苗通过诱导Foxp3^+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用
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作者 卢家美 李满祥 +4 位作者 孙秀珍 张永红 刘昀 徐晶 张苏梅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期14-19,共6页
目的构建葎草花粉变应原核酸疫苗pcDNA3.1-Hum,并探讨其是否通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用。方法双酶切pTripIEx2-Hum质粒以获取目的基因,定向插入pcDNA3.1(-)载体以构建pcDNA3.1-Hum核酸疫苗并测序鉴定... 目的构建葎草花粉变应原核酸疫苗pcDNA3.1-Hum,并探讨其是否通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用。方法双酶切pTripIEx2-Hum质粒以获取目的基因,定向插入pcDNA3.1(-)载体以构建pcDNA3.1-Hum核酸疫苗并测序鉴定,转染至COS-7细胞以证实其表达。采用表达的目的蛋白刺激CD4+CD25-T细胞,验证其能否诱导Foxp3+Treg细胞分化。使用pcDNA3.1-Hum免疫正常小鼠,检测特异性IgE、IgG2a水平以探讨其免疫原性、变应原性;免疫哮喘模型小鼠以验证其免疫保护作用。结果测序证实该构建成功并可在真核细胞内表达;证实表达的目的蛋白可诱导CD4+CD25-T细胞向Foxp3+Treg细胞分化。动物实验提示pcDNA3.1-Hum可诱导特异性IgG2a,不能诱导特异性IgE;可明显降低哮喘模型小鼠气道炎症反应、气道高反应性;升高脾脏Foxp3+Treg细胞百分比;降低IL-4、升高IFN-γ水平。结论成功构建了pcDNA3.1-Hum核酸疫苗,表达的目的蛋白可介导Foxp3+Treg细胞分化。动物实验证实该疫苗具有免疫原性及免疫保护作用,并提示其通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导Th1倾向的免疫保护作用。 展开更多
关键词 应性哮喘 葎草花粉变应原 核酸疫苗 免疫原性 Foxp3^+Treg细胞
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重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究 被引量:2
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作者 吴媛媛 孙秀珍 +3 位作者 李满祥 刘昀 王贵佐 卢家美 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1431-1434,共4页
目的鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性。方法应用Western blotting鉴定pTSX2的免疫特性;ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:ELISA法测定小鼠血清sIgE、sIgG水... 目的鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性。方法应用Western blotting鉴定pTSX2的免疫特性;ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:ELISA法测定小鼠血清sIgE、sIgG水平;计数小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞(Eos)比值;ELISA法检测小鼠BALF中及脾组织匀浆中细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平;评价小鼠肺组织炎症程度。结果 Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与70%的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应;pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:血清中sIgE、sIgG的抗体水平分别为(146.74±28.57)和(548.76±11.98)μg/ml,与哮喘模型组的(603.06±10.00)和(260.32±6.40)μg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明显下降(P<0.05);BALF中IL-4、IFN-γ水平分别为(56.74±28.57)和(49.7±11.98)pg/ml,与哮喘模型组的(89.03±10.00)和(23.10±6.40)pg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平分别为(126.24±37.00)和(1547.72±490.43)pg/ml,与哮喘模型组的(457.95±70.06)和(720.34±93.96)pg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);肺组织炎症程度减轻。结论重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用,且安全性较高,其机制可能是抑制变应原sIgE抗体、诱导变应原sIgG抗体产生,降低气道炎症细胞浸润,调节Thl/Ih2平衡。 展开更多
关键词 支气管哮喘 葎草花粉变应原 重组应原 特异性免疫治疗
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葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的构建及其免疫原性鉴定 被引量:2
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作者 张永红 孙秀珍 +1 位作者 刘昀 徐晶 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期51-53,78,共4页
目的构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA-LC2并鉴定其免疫原性。方法将pTripIEx2-LC2质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段,将其插入pcDNA3.1(-)真核表达载体,在鉴定重组质粒构建成功后,大量制备去内毒素核酸疫... 目的构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA-LC2并鉴定其免疫原性。方法将pTripIEx2-LC2质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段,将其插入pcDNA3.1(-)真核表达载体,在鉴定重组质粒构建成功后,大量制备去内毒素核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,应用pcDNA3.1-LC2核酸疫苗免疫小鼠,取免疫血清行双向免疫扩散实验,分析其免疫原性。结果通过测序确认构建pcDNA3.1-LC2中的672 bp的编码框碱基与原序列一致,没有突变及缺失。应用pcDNA3.1-LC2免疫BALB/c小鼠,经双向免疫扩散试验验证pcDNA3.1-LC2在小鼠体内可以表达并产生特异性抗体。结论成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,pcDNA3.1-LC2可在小鼠体内表达,并能产生葎草花粉变应原特异性抗体,具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 支气管哮喘 葎草花粉变应原 核酸疫苗
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葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达和免疫分析 被引量:1
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作者 卢家美 孙秀珍 +4 位作者 李满祥 刘昀 徐晶 张永红 吴媛媛 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期155-160,174,共7页
目的验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析。方法应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证... 目的验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析。方法应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证所分离出的条带与目的片段是否一致;应用pcDNA3.1-LC2免疫正常小鼠,ELISA方法测定血清中IgGI、gE浓度和脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ浓度;制备葎草花粉变应性哮喘小鼠模型,应用pcDNA3.1-LC2对葎草花粉变应性哮喘模型小鼠进行免疫治疗,行肺泡灌洗液沉渣细胞计数,肺泡灌洗液沉渣滴片瑞士染色并嗜酸性粒细胞分类计数;取左肺上叶行肺脏病理HE染色,ELISA方法测定肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ浓度,并测定血清中IgGI、gE浓度。结果琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,于750 bp处分离出一明显的条带,与目的片段一致;采用pcDNA3.1-LC2免疫正常小鼠后,血清IgG浓度升高,IgE浓度无明显变化,脾组织匀浆中IL-4浓度降低,IFN-γ浓度升高;免疫过程中未引起过敏反应、免疫损伤及急性肺损伤;应用该核酸疫苗免疫葎草花粉变应性哮喘小鼠模型,可明显降低气道炎症级别、减轻炎症细胞浸润、降低嗜酸性粒细胞百分比,引起血清中IgG浓度升高和IgE浓度降低,肺泡灌洗液中IL-4浓度降低和IFN-γ浓度升高,再次激发时哮喘症状明显减轻。结论 pcDNA3.1-LC2可在真核细胞内表达,诱导TH1/TH2平衡向TH1方向转化,具有免疫原性及免疫保护作用,安全性较好。 展开更多
关键词 支气管哮喘 葎草花粉变应原 核酸疫苗 真核表达 免疫原性
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