葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1/SLC7A11抑制铁死亡对骨肉瘤发生发展的影响

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作者 王胜涛 徐淑娟 +3 位作者 贵鹏 李欣咛 隋玉涵 李朝旭 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期11-18,共8页

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减... 目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减骨肉瘤细胞HOS和143B中SND1的表达(si-SND1),采用CCK8法、细胞克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验探究SND1的表达对骨肉瘤细胞生物学功能的影响;调控骨肉瘤细胞中SND1以及SLC7A11基因的表达,探究SND1通过SLC7A1基因对骨肉瘤铁死亡介导的肿瘤细胞凋亡的影响。结果骨肉瘤细胞Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于人成骨细胞hFOB1.19(P均<0.01)。与对照组比较,si-SND1转染显著降低HOS和143B细胞中SND1的表达水平(P均<0.01),且细胞活性显著降低,克隆形成数量显著减少,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P均<0.001)。铁死亡诱导剂Erastin促进骨肉瘤HOS和143B细胞凋亡,而抑制剂Ferrostatin-1刺激上调细胞活性(P均<0.001)。敲减SND-1后使用Erastin可进一步降低骨肉瘤HOS和143B细胞活性,而使用Ferrostatin-1刺激后可显著恢复细胞活性(P均<0.001);Erastin处理后,si-SND1组细胞中铁离子和丙二醛表达增高,谷胱甘肽表达降低(P均<0.001)。体内实验结果显示,敲减SND1可以明显抑制143B裸鼠移植瘤的瘤体质量(P<0.001)。敲减SND1后骨肉瘤HOS和143B细胞中SLC7A11的表达水平显著减少(P均<0.001),且铁死亡水平升高(P<0.001,P=0.020)。结论骨肉瘤细胞中SND1表达显著增高,其可能通过上调SLC7A11的表达抑制铁死亡,进而促进骨肉瘤细胞活性。 展开更多

关键词 骨肉瘤 葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1 铁死亡

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金黄色葡萄球菌核酸酶A在温控双表达载体中的表达及其活性分析 被引量：3

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作者 付立霞 张磊 +4 位作者 李欣容 韩先干 高波 张晓君 魏文志 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期34-37,共4页

菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表... 菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表达载体进行诱导表达并对其活性进行综合分析。结果显示,胞内和胞外产物均具有核酸酶活性,分别在升温诱导30 min和90 min后被检出,对宿主菌的4 h灭活率为99.7%,宿主基因组亦被成功降解。这表明,SNA在温控双表达载体中的表达仍能如在单表达载体中一样有效灭活细菌,裂解基因E和SNA的共表达可能才是造成上述差异的主要原因。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌核酸酶A 菌蜕 裂解基因E

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金黄色葡萄球菌核酸酶在大肠杆菌中的表达及其活性分析 被引量：2

3

作者 秦成峰 秦鄂德 +4 位作者 于曼 姜涛 陈水平 邓永强 段鸿元 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期513-515,共3页

目的:构建金黄色葡萄球菌核酸酶(SN)基因的原核表达载体,研究其在大肠杆菌中的表达,并制备兔抗SN抗体。方法:从质粒pPLCSN中扩增SN基因片段,插入表达载体pLEX后转化大肠杆菌GI724,以色氨酸诱导表达。以表达的重组蛋白免疫日本大耳白兔... 目的:构建金黄色葡萄球菌核酸酶(SN)基因的原核表达载体,研究其在大肠杆菌中的表达,并制备兔抗SN抗体。方法:从质粒pPLCSN中扩增SN基因片段,插入表达载体pLEX后转化大肠杆菌GI724,以色氨酸诱导表达。以表达的重组蛋白免疫日本大耳白兔制备抗SN抗体,用Westernblot分析兔抗SN抗体的特异性。结果:重组表达载体pLEXSN在大肠杆菌中获得表达,表达的可溶性蛋白占菌体蛋白总量的37%,具有良好的生物学活性。制备的兔抗SN抗体能够特异识别SN。结论:成功地在大肠杆菌中表达具有生物学活性的SN,并制备了兔抗SN抗体,为进一步探讨其作为抗病毒因子应用于病毒性疾病的治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 葡萄球菌核酸酶 表达 抗体 兔

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金黄色葡萄球菌核酸酶对2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎的保护作用 被引量：3

4

作者 张婷婷 梅银柳 +3 位作者 董万法 王镜勋 金亮 吴洁 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期198-205,共8页

探究金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠结肠炎的改善作用及机制。用2.5%TNBS溶液灌肠雌性BALB/c小鼠建立结肠炎模型,并连续6 d灌胃给予以重组乳酸菌为递呈载体的SNase。探究SNase介导的中性粒细胞胞外诱捕... 探究金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠结肠炎的改善作用及机制。用2.5%TNBS溶液灌肠雌性BALB/c小鼠建立结肠炎模型,并连续6 d灌胃给予以重组乳酸菌为递呈载体的SNase。探究SNase介导的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的降解对小鼠结肠炎的影响。实验分为正常组、TNBS模型组、NZ9000乳酸菌组、表达SNase的重组乳酸菌组。每日观测小鼠体质量、粪便性状和粪便隐血情况,观察期结束取结肠组织进行HE病理分析,检测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)酶活和促炎细胞因子的mRNA表达水平,检测血清炎性细胞因子含量,同时免疫组化检测结肠组织中性粒细胞及其NETs标志物的表达水平。结果表明,乳酸菌递呈的SNase能缓解TNBS诱导的结肠炎小鼠体质量下降,降低疾病活动指数(DAI)评分,缓解结肠缩短并减轻病理损伤,降低结肠组织MPO酶活及炎性细胞因子表达,同时改善了血清炎性水平,免疫组化结果表明结肠组织Ly6G和citH3水平下降。初步机制表明,SNase能够下调炎性细胞因子的表达,降低NETs水平从而缓解小鼠结肠炎。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌核酸酶 乳酸乳球菌 2 4 6-三硝基苯磺酸 中性粒细胞胞外诱捕网 结肠炎

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葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1在应激刺激下与T细胞胞内抗原1共同参与应激颗粒聚集

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作者 邵洁 张兵兵 +2 位作者 赵猛 周云丽 任丽 《天津医药》 CAS 2017年第6期561-565,共5页

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)在应激刺激下如何与T细胞胞内抗原1(TIA-1)共同参与应激颗粒(SG)的聚集以及如何调节应激反应。方法利用免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞中的SND1蛋白与TIA-1蛋白在应激刺激下是否... 目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)在应激刺激下如何与T细胞胞内抗原1(TIA-1)共同参与应激颗粒(SG)的聚集以及如何调节应激反应。方法利用免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞中的SND1蛋白与TIA-1蛋白在应激刺激下是否形成共定位颗粒,并利用绿色荧光蛋白载体过表达质粒转染HeLa细胞进行外源蛋白表达,从而确定在应激刺激下SND1蛋白与TIA-1结合的结构域。利用RNA干扰技术敲除HeLa细胞中SND1蛋白表达并利用Western Blotting检测蛋白表达水平,从而观察SND1低表达是否对TIA-1聚集形成SG产生影响。利用不同热休克刺激时间观察SND1与TIA-1的聚集过程是否存在动态变化。结果 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白结合共同参与SG聚集,其主要作用结构域为葡萄球菌核酸酶结构域(SN domain)。SND1低表达不会抑制TIA-1聚集到SG,但会减少SG的数量。在不同热休克刺激时间下,SND1聚集到SG的运输过程滞后于TIA-1。结论 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白共同参与SG的聚集,从而调节细胞应激反应。 展开更多

关键词 应激 RNA 干扰 葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1 T 细胞胞内抗原1 应激颗粒

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金黄色葡萄球菌核酸酶去C-末端肽段在E.coli中的高效表达

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作者 静国忠 刘利军 +2 位作者 刘志革 邹强 蒋美岩 《自然科学进展（国家重点实验室通讯）》 1995年第5期569-575,共7页

报道了7个金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)C-末端缺失突变体在E. coli细胞中的高效表达,其表达量可占细胞总蛋白量的16.90％～57.7％,即使仅由52个残基组成的小肽段,也能在细胞中稳定积累,然而,SNase的C-末端缺失明显地影响到肽段的分泌表... 报道了7个金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)C-末端缺失突变体在E. coli细胞中的高效表达,其表达量可占细胞总蛋白量的16.90％～57.7％,即使仅由52个残基组成的小肽段,也能在细胞中稳定积累,然而,SNase的C-末端缺失明显地影响到肽段的分泌表达水平乃至越膜分泌。实验指出,7个肽段都能同抗SNase多克隆抗体呈特异性免疫反应,较长的肽段仍保留着不同程度的SNase的催化活性。 展开更多

关键词 葡萄球菌核酸酶 去C-末端肽段 蛋白质 肽

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葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 被引量：2

7

作者 洪流 郎君超 +2 位作者 贺冬梅 刘坤锋 吴洁 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期214-219,共6页

为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/p ET28aHis-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体p... 为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/p ET28aHis-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体pET28a-His-SNase,再转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经过乳糖诱导表达、超声破碎及镍柱亲和色谱等纯化步骤后,以SDS-PAGE和Western blot鉴定His-SNase,并对其性质进行了初步研究。结果表明,乳糖诱导后HisSNase能高效表达,亲和色谱后纯度高达85%以上,且其具备较高的核酸酶活性,作用pH范围较广,有很好的耐热性。本研究为进一步探究葡萄球菌核酸酶与糖尿病的关系奠定了基础。 展开更多

关键词 糖尿病 葡萄球菌核酸酶 组氨酸标签 分离纯化

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金黄色葡萄球菌核酸酶C末端去9肽对酶蛋白溶液构象的影响 被引量：3

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作者 徐立东 童宇峰 王金凤 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期7-12,共6页

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶(含149个氨基酸残基),酶蛋白1～140片段(SNase140)以及在TMP(thymidine 5’-monophosphate)和Ca^(2+)存在下的SNase140的溶液构象状态... 通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶(含149个氨基酸残基),酶蛋白1～140片段(SNase140)以及在TMP(thymidine 5’-monophosphate)和Ca^(2+)存在下的SNase140的溶液构象状态。探讨了酶蛋白C末端去9肽后对酶蛋白构象和活力的影响。研究指出,远离酶蛋白活性部位残基间相互作用的变化,将通过酶蛋白两个亚结构域之间所形成的氢键,影响酶蛋白活性部位的空间构象,从而影响酶蛋白的活力。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌核酸酶 多维核磁共振 N端140片段

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葡萄球菌核酸酶蛋白的时间分辨荧光与热力学特性 被引量：1

9

作者 常孟方 贾梦辉 +2 位作者 李磊 陈缙泉 徐建华 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2018年第5期1451-1457,共7页

葡萄球菌核酸酶(SNase)是一种小型球状蛋白,其变体常用来研究蛋白质的折叠过程。不同于之前报道的研究方法和技术手段,采用时间相关单光子计数(TCSPC)及飞秒荧光上转换技术,结合紫外吸收谱和稳态荧光光谱,研究了SNase蛋白变体Δ+PHS和Δ... 葡萄球菌核酸酶(SNase)是一种小型球状蛋白,其变体常用来研究蛋白质的折叠过程。不同于之前报道的研究方法和技术手段,采用时间相关单光子计数(TCSPC)及飞秒荧光上转换技术,结合紫外吸收谱和稳态荧光光谱,研究了SNase蛋白变体Δ+PHS和Δ+PHS+I92A的荧光动力学,以及不同温度下蛋白结构与热稳定性的关系,证明蛋白质内色氨酸残基可作为一种内源性探针对蛋白变体的结构折叠和热稳定性进行印证和研究。衰减相关光谱(DAS)表明了两种变体随温度变化的不同趋势,在此基础上进一步分析了这两种变体的结构折叠及热稳定性的差异。皮秒时间分辨发射光谱(TRES)显示色氨酸残基存在0.5ns的连续光谱弛豫过程,而光谱移动量可作为SNase变体蛋白结构紧密程度的判断依据。飞秒上转换数据分析结果中,0.5ps的DAS在光谱蓝端为正、红端为负,表明了色氨酸残基受到弛豫效应的影响。200ps的寿命则说明色氨酸残基与周围猝灭基团之间存在电子转移过程。时间分辨荧光各向异性(anisotropy)的分析结果则说明了色氨酸残基在蛋白质体系内具有独立的局部运动,且其强弱与变体的热稳定性和热运动的整体效果有关。测量和分析色氨酸残基的时间分辨荧光性质为深入研究SNase蛋白的结构和功能提供了新的思路。 展开更多

关键词 时间分辨荧光 色氨酸 荧光动力学 葡萄球菌核酸酶

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葡萄球菌核酸酶对金黄色葡萄球菌和其他细菌生物被膜形成的抑制作用 被引量：11

10

作者 唐俊妮 康名松 +4 位作者 陈焕春 史贤明 周锐 陈娟 杜怡午 《中国科学：生命科学》 CSCD 北大核心 2011年第7期586-592,共7页

葡萄球菌核酸酶是金黄色葡萄球菌(Staphylococ cusaureus)的一个重要毒力因子,它的生物学作用仍没有完全阐述清楚.本研究观察到金黄色葡萄球菌核酸酶产生菌株的生物被膜形成受到明显抑制.葡萄球菌核酸酶是由nuc1基因编码,当nuc1基因被... 葡萄球菌核酸酶是金黄色葡萄球菌(Staphylococ cusaureus)的一个重要毒力因子,它的生物学作用仍没有完全阐述清楚.本研究观察到金黄色葡萄球菌核酸酶产生菌株的生物被膜形成受到明显抑制.葡萄球菌核酸酶是由nuc1基因编码,当nuc1基因被敲除后,突变菌株生物被膜形成能力大大增加.扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜用于评价nuc1基因在生物被膜形成中的作用.另外,nuc1基因编码的产物——葡萄球菌核酸酶和NUC1重组蛋白对其他生物被膜形成细菌(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis))同样有明显抑制作用.本研究表明,葡萄球菌核酸酶和生物被膜的形成之间有直接联系,并且葡萄球菌核酸酶起着抑制生物被膜形成的重要作用,为研究葡萄球菌核酸酶的生物学作用和理解葡萄球菌核酸酶抑制生物被膜形成提供理论依据. 展开更多

关键词 生物被膜形成 nuc1基因 葡萄球菌核酸酶 抑制 金黄色葡萄球菌

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金黄色葡萄球菌核酸酶A与不同外源DNA片段融合表达的作用比较 被引量：2

11

作者 付立霞 冀德君 +2 位作者 卢徐斌 韩先干 魏文志 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1654-1663,共10页

金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。... 金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。为厘清这一争议,分别构建一系列含SNA、SNA与λ噬菌体cro基因或结核杆菌脲酶基因部分序列的融合片段c SNA或u SNA的温控质粒并对其在大肠杆菌内的作用进行评价。结果显示,SNA、c SNA和u SNA的表达产物对大肠杆菌的4 h灭活率分别为99.9%、99.8%和74.2%。升温诱导30 min后,SNA和c SNA即可在宿主菌胞内被检出,而u SNA需1 h;相较之下,SNA和c SNA在培养液上清中的被检出时间要晚1 h,u SNA则晚2 h。对三者的核酸酶活性检测均为:SNA﹥c SNA﹥u SNA,且胞外活性都显著低于胞内。此外,SNA和c SNA在诱导2 h后即将宿主基因组成功降解,而u SNA则在整个实验期间均未能使宿主基因组完全降解。这表明SNA、c SNA和u SNA的表达产物均具有核酸酶活性,可被动释放至胞外,外源DNA片段的融入反而会降低SNA的核酸酶活性。 展开更多

关键词 菌蜕 cro基因 裂解基因E 金黄色葡萄球菌核酸酶A 脲酶基因

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登革病毒衣壳蛋白与葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达 被引量：2

12

作者 秦成峰 胡志君 +6 位作者 陈水平 范宝昌 于曼 姜涛 邓永强 段鸿元 秦鄂德 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2004年第5期430-432,491,共4页

目的 :实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法 :利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体 pLEX ,转化大肠杆菌GI72 4并以色氨酸诱导表达 ,用SDS PAGE和免疫印迹法鉴定表达... 目的 :实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法 :利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体 pLEX ,转化大肠杆菌GI72 4并以色氨酸诱导表达 ,用SDS PAGE和免疫印迹法鉴定表达的融合蛋白 ,采用TDA显色法检测融合蛋白中SN的活性。结果与结论 :成功构建重组表达载体pLEX CSN并在大肠杆菌中获得表达 ,表达的融合蛋白相对分子质量约 2 70 0 0 ,可被抗登革病毒C蛋白抗体识别 ,并具有SN的生物活性。为探讨登革病毒衣壳蛋白靶向性抗病毒作用奠定了基础。 展开更多

关键词 登革病毒 衣壳蛋白 葡萄球菌核酸酶 融合蛋白 表达

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NaCl浓度对金黄色葡萄球菌核酸酶酸变性态结构的影响 被引量：1

13

作者 毕喜平 蒋美岩 静国忠 《中国科学（B辑）》 CSCD 北大核心 1995年第1期60-65,共6页

金黄色葡萄球菌核酸酶类似物(SNaseR)的酸变性态(U_A)在较高NaCl浓度下可转变为另一种稳定的酸变性态(A态),即U_A→A.CD谱测定结果表明A态结构中具有大量二级结构.体积排除色谱测定表明A态具有接近于天然态的堆积密度.A态可与疏水性荧... 金黄色葡萄球菌核酸酶类似物(SNaseR)的酸变性态(U_A)在较高NaCl浓度下可转变为另一种稳定的酸变性态(A态),即U_A→A.CD谱测定结果表明A态结构中具有大量二级结构.体积排除色谱测定表明A态具有接近于天然态的堆积密度.A态可与疏水性荧光探针ANS结合.A态的这些特征表明其结构类似于熔球态.NaCl和HCl诱寻的U_A→A构象转变曲线相互重合,表明U_A→A转变是由C1^-与A态酶分子结合所引起的.C1^-结合到A态酶分子上稳定了该酶的α螺旋结构.盐酸胍可使A态发生变性. 展开更多

关键词 葡萄球菌核酸酶 熔球态 酸变性态 氯化钠 球蛋白

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裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备 被引量：6

14

作者 王丽哲 雷连成 韩文瑜 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第8期557-561,共5页

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助... 目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。 展开更多

关键词 噬菌体PhiX174 裂解基因E 葡萄球菌核酸酶A 菌影

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猪瘟病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及鉴定 被引量：3

15

作者 周斌 刘珂 陈溥言 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期451-455,共5页

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(C)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码猪瘟病毒衣壳蛋白的C基因,将其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN)基因的真核表达载体pcDNA-SN中,筛选获得重组质粒pcDNA-C-SN。脂质体转染猪肾细胞(PK-15),并经G418稳定筛选... 根据猪瘟病毒衣壳蛋白(C)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码猪瘟病毒衣壳蛋白的C基因,将其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN)基因的真核表达载体pcDNA-SN中,筛选获得重组质粒pcDNA-C-SN。脂质体转染猪肾细胞(PK-15),并经G418稳定筛选,通过RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光鉴定表达的融合蛋白,体外DNA消化试验检测核酸酶活性。结果表明融合蛋白C-SN在PK-15细胞中获得了稳定表达,能够被兔抗猪瘟病毒衣壳蛋白多抗所识别,并具有良好的核酸酶活性,能够对DNA进行切割。同时,稳定表达融合蛋白C-SN的PK-15细胞系中能够有效抑制猪瘟野毒的增殖,使其感染性降低102～103倍。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 衣壳蛋白 葡萄球菌核酸酶 抗病毒感染

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登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用 被引量：1

16

作者 秦成峰 秦鄂德 +4 位作者 于曼 姜涛 陈水平 段鸿元 邓永强 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期757-761,共5页

根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒... 根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒pcDNA D2C SN .电穿孔转染BHK细胞后 ,5mg Lblasticidin压力筛选 ,通过RT PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定表达的蛋白 ,体外DNA消化试验检测核酸酶活性 .结果表明 ,融合蛋白D2C SN在BHK细胞中获得了稳定表达 ,表达的融合蛋白能够被抗登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别 ,并具有良好的核酸酶活性 ,能够对DNA进行切割 .同时 ,BHK细胞中稳定表达的融合蛋白D2C SN能够有效抑制登革病毒的增殖 ,使其感染性降低 10 3 ～ 10 4倍 . 展开更多

关键词 靶向核酸酶 登革病毒 葡萄球菌核酸酶 抗病毒

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破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建 被引量：1

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作者 张君 方宏清 +2 位作者 戴红梅 谢达平 陈惠鹏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期46-52,共7页

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良,构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌,该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽... 研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良,构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌,该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S.aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E.coli BL21(DE3)的lpxM位点,改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间,这样可使宿主核酸免受该酶"毒性"影响,菌体裂解后,nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。 展开更多

关键词 E.COLI BL2I(DE3) Red同源重组系统 IpxM 金黄色葡萄球菌核酸酶

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SND1通过识别TINCR的甲基化位点促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长 被引量：2

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作者 秦高平 孙要文 +4 位作者 郭亚东 李建武 程亮 韩峰 宋勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1068-1076,共9页

目的探讨葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1(SND1)与组织分化诱导非编码RNA(TINCR)的相互作用及其对TINCR表达水平和瘢痕疙瘩生长的影响。方法收集2016年6月-2018年5月在陕西省人民医院接受治疗的Ⅱ、Ⅲ度烧伤患者的瘢痕疙瘩组织样本(n=27)。... 目的探讨葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1(SND1)与组织分化诱导非编码RNA(TINCR)的相互作用及其对TINCR表达水平和瘢痕疙瘩生长的影响。方法收集2016年6月-2018年5月在陕西省人民医院接受治疗的Ⅱ、Ⅲ度烧伤患者的瘢痕疙瘩组织样本(n=27)。运用生物信息学方法预测TINCR序列中的RNA甲基化位点;培养人原代正常皮肤成纤维细胞(HFs)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs),设置HFs组和KFs组。取对数生长期KFs,设置:(1)对照组、空载组及甲基转移酶样蛋白3(METTL3)过表达组;(2)对照组和3-脱氮基腺苷(DAA)组;(3)对照组、SND1重组蛋白组及SND1重组蛋白+DAA组。采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测HFs和KFs中TINCR的相对表达水平,甲基化RNA免疫沉淀技术(MeRIP)联合RT-qPCR检测TINCR的甲基化水平,Western blotting检测SND1和METTL3蛋白的相对表达水平,放线菌素D处理联合RT-qPCR检测TINCR残留水平,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力。取18只BALB/c裸鼠,构建瘢痕疙瘩异种移植模型,随机分为瘢痕疙瘩组、瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组及瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白+DAA组,每组6只,采用HE染色观察瘢痕疙瘩组织生长情况,免疫组化染色和Western blotting检测SND1在瘢痕疙瘩组织中的表达水平。结果TINCR第三外显子含有7个潜在的RNA甲基化位点。与HFs相比,KFs中TINCR相对表达水平(5.43±0.35 vs.1.00±0.11,P<0.01)和甲基化水平(19.73%±1.56%vs.10.25%±1.13%,P<0.01)均明显升高,SND1和METTL3蛋白相对表达水平明显增高(P<0.01),甲基化的TINCR与SND1和METTL3均有结合。与空载组相比,METTL3过表达可促进METTL3 mRNA和蛋白的表达(mRNA:6.03±0.55 vs.1.09±0.09,P<0.01;蛋白:4.33±0.35 vs.0.96±0.08,P<0.01)、增高TINCR甲基化水平(32.89%±2.88%vs.19.04%±1.72%,P<0.01)和相对表达水平(4.65±0.32 vs.1.00±0.10,P<0.01)。与对照组相比,DAA处理可降低TINCR的稳定性[(8.50±1.13)h vs.(12.90±1.41)h,P<0.001]和甲基化水平(7.43%±0.55%vs.18.88%±1.76%,P<0.01),抑制KFs的活力和克隆形成能力(P<0.01)。与对照组相比,SND1重组蛋白处理可增加TINCR的稳定性[(23.95±1.25)h vs.(13.10±1.33)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力(P<0.01),但对TINCR甲基化水平(20.15%±1.74%vs.19.04%±1.77%,P>0.05)无明显影响;DAA处理可消除SND1重组蛋白对TINCR稳定性[(12.00±1.21)h vs.(23.95±1.44)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力的影响(P<0.01)。与瘢痕疙瘩组相比,瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组真皮层有大量成纤维细胞和胶原纤维,瘢痕疙瘩组织中SND1阳性细胞百分比(63.43%±3.32%vs.21.16%±4.67%,P<0.01)和蛋白相对表达水平(2.54±0.13 vs.1.00±0.10,P<0.01)明显增高;而经DAA处理后,瘢痕疙瘩组织中有大量疏松的胶原纤维,SND1阳性细胞百分比(38.52%±6.88%vs.63.43%±3.32%,P<0.01)和蛋白表达水平(1.07±0.09 vs.2.54±0.13,P<0.01)明显降低。结论KFs中TINCR呈高甲基化水平,SND1可识别并结合TINCR的甲基化位点,增强TINCR的稳定性,促进TINCR介导的瘢痕疙瘩生长。 展开更多

关键词 组织分化诱导非编码RNA 葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1 RNA甲基化 RNA稳定性 细胞增殖 成纤维细胞 瘢痕疙瘩

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利用温控双表达载体制备印第安纳沙门菌菌蜕 被引量：1

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作者 龚建森 徐敬潇 +4 位作者 付立霞 韩先干 张笛 董永毅 徐步 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期246-251,264,共7页

为制备安全高效的印第安纳沙门菌菌蜕,本研究以温控质粒pTCV为载体,分别构建出只含噬菌体PhiX174裂解基因E的pTCK01质粒、同时含裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A(SNA)的pTCK02质粒及对裂解基因E和SNA密码子优化后的p TCK03质粒,分别... 为制备安全高效的印第安纳沙门菌菌蜕,本研究以温控质粒pTCV为载体,分别构建出只含噬菌体PhiX174裂解基因E的pTCK01质粒、同时含裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A(SNA)的pTCK02质粒及对裂解基因E和SNA密码子优化后的p TCK03质粒,分别转化印第安纳沙门菌S1105后经42℃诱导表达,并对各重组菌开展溶菌动力学监测、重组菌的基因组电泳检测和菌蜕电镜观察。PCR鉴定结果表明,重组质粒pTCK01、pTCK02和pTCK03均正确构建。溶菌动力学显示,含质粒pTCK03的重组菌S1105(pTCK03/S1105)的OD600nm值在诱导后120 min达到最低,且低于重组菌p TCK01/S1105和重组菌pTCK02/S1105,之后一直稳定在最低水平;其溶菌率也显著高于pTCK01/S1105和p TCK02/S1105(p<0.05)。基因组电泳检测结果显示,pTCK03/S1105基因组在诱导1 h后即被降解且降解得最彻底。扫描和透射电镜观察结果显示,pTCK03/S1105菌蜕表面形态明显皱缩,胞质内容物完全释放。上述结果表明,通过优化裂解基因E和SNA密码子可提高印第安纳沙门菌菌蜕的裂解效率,并彻底降解了其遗传物质,本研究为印第安纳沙门菌菌蜕疫苗的研发提供新思路和参考。 展开更多

关键词 菌蜕 印第安纳沙门菌 双表达载体 裂解基因E 金黄色葡萄球菌核酸酶A

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重组双基因鸭源大肠杆菌菌蜕的制备 被引量：1

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作者 彭凌 杨旭夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期639-642,共4页

目的利用裂解E基因和葡萄球菌核酸酶A(SN)基因的表达,制备鸭源大肠杆菌(E.coli)菌蜕。方法通过将带有裂解E基因和葡萄球菌核酸酶A(SN)基因的质粒pET29a-E-S转化至鸭源E.coli O_(92)中,对E.coli O_(92)(pET29a-E-S)进行诱导,每隔30min检... 目的利用裂解E基因和葡萄球菌核酸酶A(SN)基因的表达,制备鸭源大肠杆菌(E.coli)菌蜕。方法通过将带有裂解E基因和葡萄球菌核酸酶A(SN)基因的质粒pET29a-E-S转化至鸭源E.coli O_(92)中,对E.coli O_(92)(pET29a-E-S)进行诱导,每隔30min检测菌液的OD_(600)值,并检测培养液中所含DNA。结果通过诱导,E.coli O_(92)(pET29a-E-S)OD_(600)值在诱导90min后开始持续下降,180min时开始趋于平稳,到360min溶菌效率达99.999%。并且葡萄球菌核酸酶把DNA降解为50~400bp的小片断。结论通过裂解E基因和SN基因表达,成功制备了E.coli O_(92)菌蜕,本实验为进一步研究该菌蜕疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌 菌蜕 裂解 E基因 葡萄球菌核酸酶A

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