天蚕素A-蜂毒素杂合肽用pBV220载体的表达、纯化和活性测定 被引量：11

1

作者 王云起 刘飞鹏 +2 位作者 李月琴 张欣 蔡继业 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期29-33,共5页

为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首... 为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首先将其拼接成融合肽的完整基因,然后通过前后接头将融合肽基因连接成两侧具有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。将5份拷贝的基因克隆至pBV220表达载体,转化E.coliDH5α,温度诱导得到表达量为35%的融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体溶解,经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析获得纯化的融合蛋白。融合蛋白再经CNBr切割和阳离子交换层析,得到纯化的抗菌肽,经蛋白质N端测序确认序列正确。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。 展开更多

关键词 天蚕素A-蜂毒素杂合肽 pbv220载体 基因表达 基因纯化 基因活性 抗菌肽 免疫系统

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pBV220载体中外源基因表达水平定量分析 被引量：29

2

作者 李伍举 吴加金 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第2期126-133,共8页

运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术，分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平。结果表明：５′端－３０～３９区域和３′端３０～－３９区... 运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术，分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平。结果表明：５′端－３０～３９区域和３′端３０～－３９区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义；其次是３′端９ｂｐ的局部密码子偏性，ＳＤ序列与起始密码子ＡＴＧ之间碱基数在８±３范围内与表达水平无显著关系。另外，运用判别分析方法构建了判别函数，判别符合率高达９５．５％。 展开更多

关键词 基因载体 pbv220载体 表达水平 外源基因

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pBV220载体中外源基因高效表达的自动化设计 被引量：2

3

作者 查磊 应晓敏 +4 位作者 王立贵 曹源 骆志刚 苑波 李伍举 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期379-382,共4页

pBV220载体是国内科学家构建的原核系统表达载体,目前仍在广泛应用.但是,实现外源基因的高效表达需要综合考虑诸如RNA二级结构等多种因素,极其耗时费力.为此,基于我们提出的pBV220载体中外源基因高效表达数学模型,编写了外源基因高效表... pBV220载体是国内科学家构建的原核系统表达载体,目前仍在广泛应用.但是,实现外源基因的高效表达需要综合考虑诸如RNA二级结构等多种因素,极其耗时费力.为此,基于我们提出的pBV220载体中外源基因高效表达数学模型,编写了外源基因高效表达的自动化设计软件,并可定性用于原核系统其它载体中外源基因表达水平分析,最终为加快实验进程提供帮助. 展开更多

关键词 pbv220 高效表达 自动化设计

原文传递

pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系 被引量：3

4

作者 李伍举 吴加金 《生物技术通讯》 CAS 1996年第4期149-151,共3页

运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意... 运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义,并运用Bays判别分析方法构建了判别函数,判别符合率为87.5％。 展开更多

关键词 pbv220载体 表达水平 RNA二级结构 判别分析

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IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化 被引量：3

5

作者 程太平 荣俊 +3 位作者 刘晓娜 邹浩勇 齐晓亮 樊友净 《动物医学进展》 CSCD 2007年第4期9-13,共5页

采用三角瓶小量法振荡培养，对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。在37。C时诱导，对起始OD600值（0．40±0．025～0．65±0．025）进行筛选；在42℃时诱导，对起始OD600值（O．... 采用三角瓶小量法振荡培养，对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。在37。C时诱导，对起始OD600值（0．40±0．025～0．65±0．025）进行筛选；在42℃时诱导，对起始OD600值（O．40±0．025～0．65±0．025）进行筛选；在37℃和42℃时诱导，分别对诱导时间（5、6、7、8h）及待选培养基（R1、R2、R3）进行筛选。以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价。结果表明，37℃时诱导，最适宜起始OD600为0．45±0．025，最佳诱导时间为7h，最佳培养基是R1；42℃时诱导，最适宜起始OD600为0．40±0．025，最佳诱导时间为5h，最佳培养基是R2。42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时。因此，以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDVVP2基因，在37℃时诱导表达要比42℃时好。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病病毒 pbv220 表达优化 大肠埃希菌BL21

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pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达 被引量：1

6

作者 安云庆 刘箐 +1 位作者 柯岩 沈海中 《首都医科大学学报》 CAS 2001年第1期1-5,共5页

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重... ①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。 展开更多

关键词 重组杀菌 渗透增强蛋白 pbv220表达载体 PUC18克隆载体

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hKGF2在不同原核载体中的构建、表达和纯化分析 被引量：2

7

作者 游力 余德荣 +3 位作者 许晓群 王郡甫 高春义 赵跃然 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2008年第12期1115-1119,共5页

目的比较人角质细胞生长因子2(hKGF2)在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后,分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接,转化不同宿主菌... 目的比较人角质细胞生长因子2(hKGF2)在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后,分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接,转化不同宿主菌进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot进行蛋白鉴定。针对不同原核表达载体分别用阳离子交换层析和镍亲和层析(Ni-NTA)纯化目的蛋白,电泳分析蛋白纯化结果,并分别检测其生物学活性。结果目的基因片段克隆入pBV220载体后在E.coliJM109中表达量最高,约占菌体总蛋白的15%;克隆入pET-30a(+)载体在E.coliBL21(DE3)中表达量约占菌体总蛋白的25%;均为可溶性表达,不同方法纯化后蛋白纯度达95%以上,均能有效促进人胚胎肾上皮细胞增殖。结论hKGF2基因在不同的宿主菌中蛋白表达不同,以融合蛋白表达纯化效果更好。 展开更多

关键词 人角质细胞生长因子2 pbv220载体 pET-30a(+)载体 基因表达 蛋白纯化

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重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

8

作者 桂俊豪 金明 +7 位作者 赵晶 贾林涛 许彦鸣 于翠娟 王成济 杨安钢 周常文 仇东辉 《西北国防医学杂志》 CAS 2003年第5期364-366,共3页

目的 :构建三种重构型人caspase - 8基因的原核表达载体 ,转染大肠杆菌并诱导其表达。方法 :将人caspase- 8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase - 8基因克隆入原核表达载体pBV2 2 0 ,转染大肠杆菌并诱导表达... 目的 :构建三种重构型人caspase - 8基因的原核表达载体 ,转染大肠杆菌并诱导其表达。方法 :将人caspase- 8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase - 8基因克隆入原核表达载体pBV2 2 0 ,转染大肠杆菌并诱导表达。结果 :成功构建了三种重构型人caspase- 8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后 ,经温度诱导 ,重构型人caspase - 8基因获得了高效的表达。结论 :在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase - 8基因。 展开更多

关键词 人caspase—8基因 pbv220 原核表达

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温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化 被引量：2

9

作者 王宏伟 金宁一 +2 位作者 龚伟 苏忠兰 殷震 《武汉大学学报（自然科学版）》 CSCD 1999年第4期505-508,共4页

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５，该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签，利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ... 通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５，该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签，利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点，构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连，利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱，对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化， 其纯度超过 ８０％ ；对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化，产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 展开更多

关键词 HIV-1 衣壳蛋白 原核表达载体 纯化 pbv220

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金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建 被引量：1

10

作者 谭洁莹 付欣 李冰 《实用医学杂志》 CAS 2008年第14期2370-2372,共3页

目的:构建表达金属硫蛋白(metallo thionein,MT)的非融合性原核表达载体。方法:以大肠杆菌BL21中的PET-GST-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pBV220载体,转入大肠杆菌DH-5α中。结... 目的:构建表达金属硫蛋白(metallo thionein,MT)的非融合性原核表达载体。方法:以大肠杆菌BL21中的PET-GST-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pBV220载体,转入大肠杆菌DH-5α中。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致,测序结果正确。结论:成功构建MT原核表达载体,为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础。 展开更多

关键词 金属硫蛋白 基因重组 pbv220载体 非融合表达

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人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定 被引量：4

11

作者 宋小双 聂盼 +1 位作者 马永鹏 刘堰 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期93-97,共5页

根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对... 根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切鉴定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础. 展开更多

关键词 大肠杆菌表达系统 白细胞介素-2突变体 克隆 表达载体pbv220

原文传递

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达 被引量：1

12

作者 余瑞元 王燕峰 +1 位作者 孙久荣 徐长法 《生物工程进展》 CSCD 2000年第2期55-57,共3页

采用PCR技术 ,删除了小鼠CREBcDNA5′端和 3′端非编码序列 ,并引入便于基因操作的酶切位点。经 30次循环的扩增 ,得到改造后的CREBcDNA ,全长 10 71bp。亚克隆后 ,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析 ,测定了DNA序列 ,并以其... 采用PCR技术 ,删除了小鼠CREBcDNA5′端和 3′端非编码序列 ,并引入便于基因操作的酶切位点。经 30次循环的扩增 ,得到改造后的CREBcDNA ,全长 10 71bp。亚克隆后 ,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析 ,测定了DNA序列 ,并以其为插入物 ,构建了 pBV2 2 0 -PCR -CREB重组表达载体。经Western印迹法分析证明 。 展开更多

关键词 CREBcDNA PCR 序列分析 表达载体pbv220

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PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达 被引量：9

13

作者 高云 杨汉春 +4 位作者 刘平黄 陈声 郭鑫 韩军 黄芳芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期438-440,共3页

用表达非融合蛋白的原核表达载体 p BV2 2 0 ,通过 PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征( PRRS)病毒 BJ-4株核衣壳蛋白 ( N)基因起始密码子上游进行了改造和修饰 ,成功地构建了含有 PRRS病毒 N基因的原核重组表达载体 p BV-N。 p BV-... 用表达非融合蛋白的原核表达载体 p BV2 2 0 ,通过 PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征( PRRS)病毒 BJ-4株核衣壳蛋白 ( N)基因起始密码子上游进行了改造和修饰 ,成功地构建了含有 PRRS病毒 N基因的原核重组表达载体 p BV-N。 p BV-N转化大肠杆菌 DH5α,温度诱导后菌体裂解物经 SDS-PAGE分析发现 ,在约 1 5 0 0 0处出现 1条诱导前后的 p BV2 2 0载体对照和诱导前的 p BV-N中均缺少的特异性的蛋白条带 ,分子量大小与 PRRS病毒 N蛋白相符 ,并随着诱导时间的延长而变化 ,在诱导后 4 h达到高峰。薄层扫描结果显示 ,重组 N蛋白表达量最多可占菌体总蛋白的 2 7.4 %。 Western-blotting检测 ,此 1 5 0 0 0的蛋白带可为 PRRS病毒 N蛋白的单克隆抗体所识别 ,表明该重组 展开更多

关键词 PRRS病毒 核衣壳蛋白 原核表达 pbv220 猪繁殖与呼吸综合征 PRRS

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粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立 被引量：2

14

作者 李福胜 贡惠宇 +5 位作者 赵炳文 余彩玲 侯斌 陈爱君 张智清 侯云德 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第5期479-484,共6页

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上，重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰，修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组... 基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上，重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰，修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性，建立了一条简便、稳定，适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体，８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体，稀释复性蛋白，之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白，每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底。 展开更多

关键词 G-CSF 原核表达 纯化 pbv220 基因修饰

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人可溶性白介素4受体(sIL4R)在大肠杆菌中的表达和纯化 被引量：1

15

作者 张勇 王渭池 李元 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期778-784,共7页

白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活... 白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂 ,应用于哮喘等疾病治疗 .采用RT PCR方法 ,以人单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序确证后插入大肠杆菌高效表达质粒pBV2 2 0 ,得到重组质粒pBV2 2 0 sIL 4R ,重组质粒转化E .coliDH5α .重组菌经温度诱导后超声破碎得到包涵体 ,经SuperdexHR75分子筛柱和DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱进行纯化 ,HPLC检测表明纯度达到 90 % .N端测序证明 ,重组sIL 4R与天然sIL 4RN端序列完全一致 .Western印迹、配基结合印迹对重组sIL 4R进行鉴定 .结果表明 ,重组sIL 4R具有结合IL 展开更多

关键词 人可溶性白介素-4受体 pbv220 表达与纯化

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HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达 被引量：1

16

作者 董梅 鲁晓青 +1 位作者 陈向伟 王斌 《山西医科大学学报》 CAS 2001年第6期481-483,共3页

目的　克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp4 1。 方法　应用PCR技术 ,纯化HIV 1SF2 株外膜蛋白env基因 (gp4 1) ,并重组入原核高效表达载体 pBV2 2 0 ,在大肠杆菌HB10 1中进行表达。 结果　SDS PAGE电泳结果表明 ,在 4 4 0 0 0处有一条蛋白表... 目的　克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp4 1。 方法　应用PCR技术 ,纯化HIV 1SF2 株外膜蛋白env基因 (gp4 1) ,并重组入原核高效表达载体 pBV2 2 0 ,在大肠杆菌HB10 1中进行表达。 结果　SDS PAGE电泳结果表明 ,在 4 4 0 0 0处有一条蛋白表达带。Westernblot证明 ,4 4 0 0 0蛋白带可与HIV 1阳性血清发生特异性反应。结论　该重组表达 gp4 1的融合蛋白 ,可为HIV 1gp4 1。 展开更多

关键词 HIV-1SF2株 HIV包膜蛋白质gp41 pbv220 原核表达 基因 克隆 大肠杆菌

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人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：1

17

作者 杜广营 《烟台大学学报（自然科学与工程版）》 CAS 2008年第1期40-45,共6页

研究目的:克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化.方法:从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表... 研究目的:克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化.方法:从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV-EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白.结果:所表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对表观分子质量约为31 kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46%;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性.结论:成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础. 展开更多

关键词 人肠激酶轻链 pbv220 基因工程 原核表达

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丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及表达

18

作者 孙菊 楚雍烈 +3 位作者 姜凤良 景晓红 柴长斌 解颖馨 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期609-611,615,共4页

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。... 目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。经鉴定后温度诱导表达,采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测核心蛋白基因的蛋白表达。结果经温度诱导后获得目的基因的非融合表达,SDS-PAGE电泳显示在14000 u处有一表达条带;Western-blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白基因成功表达,对临床诊断试剂和HCV基因疫苗的研制有一定的意义。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 核心蛋白 pbv220载体 基因表达

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IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

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作者 杜广营 张国营 +2 位作者 刘昆 栾金灵 段慧英 《烟台大学学报（自然科学与工程版）》 CAS 北大核心 2011年第2期116-120,共5页

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体... 构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础. 展开更多

关键词 白细胞介素-18 白细胞介素-2 pbv220载体 原核表达 融合蛋白

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人源S100A1蛋白的表达纯化与鉴定

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作者 刘子泉 陈昀 +3 位作者 王天辉 徐传香 张娜 刘洪涛 《解放军预防医学杂志》 CAS 2011年第4期240-244,共5页

目的构建pBV220-S100A1表达载体,表达并纯化人源S100A1蛋白,为进一步研究人源S100A1蛋白相关的生物学功能及应用于临床诊断奠定基础。方法采用全基因合成法合成人源S100A1基因;通过GeneBank查询人源S100A1蛋白的氨基酸序列,进行序列优... 目的构建pBV220-S100A1表达载体,表达并纯化人源S100A1蛋白,为进一步研究人源S100A1蛋白相关的生物学功能及应用于临床诊断奠定基础。方法采用全基因合成法合成人源S100A1基因;通过GeneBank查询人源S100A1蛋白的氨基酸序列,进行序列优化设计,同时引入EcorI和BamHI酶切位点,构建原核表达载体pBV220-S100A1,热应激诱导其在大肠杆菌(E.coli DH5α)中表达,采用离子交换层析法纯化人源S100A1蛋白,最后采用Transwell迁移实验检测所纯化蛋白的生物活性。结果酶切鉴定和测序分析显示,人源S100A1的基因被成功插入pBV220多克隆位点;S100A1的基因片段在pBV220中的插入位点、碱基序列及读码框和终止子的次序完全正确;S100A1的基因序列位于表达载体pBV220的序列下游。经诱导表达和纯化,最终获得了人源S100A1蛋白,且经迁移实验证明,该纯化蛋白具有较高的生物活性。结论成功建立了人源S100A1蛋白表达载体,表达菌株经诱导表达和纯化,获得了高纯度的蛋白。 展开更多

关键词 人源S100A1 pbv220-S100A1表达载体 纯化

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