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大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5′端调控序列初步分析 被引量：4
1
作者 程璘令 李冰 +2 位作者 涂洪斌 刘启才 冉丕鑫 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期164-168,共5页
目的　分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因 5′端调控区域和相应转录因子的特性。方法　克隆 1 760bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC... 目的　分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因 5′端调控区域和相应转录因子的特性。方法　克隆 1 760bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的 5′端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其 11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验 (EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子。结果　实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的 11个缺失体。将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性:GCLC Luc(-1 758 /+2 Luc),缺失体 1(-1 231 /+2 Luc),缺失体 2(-1 108 /+2 Luc),缺失体 3(-1 087 /+2 Luc),缺失体 4(-876 /+2 Luc),缺失体 5(-745 /+2 Luc),缺失体 6(-705 /+2 Luc),缺失体 8(-613 /+2 Luc),缺失体 9(-595 /+2 Luc),缺失体 10( -403 /+2 Luc)和缺失体 11( -111 /+2 Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)。 展开更多
关键词 大鼠 基因 Γ谷氨酰半胱氨酸合成酶 转录因子 转染 亚单位 AP-1 构建 区域 结论
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β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响
2
作者 崔力军 洪玮 +2 位作者 付欣 冉丕鑫 李冰 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2010年第3期177-182,共6页
目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer... 目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体（GCLC—Luc）转染大鼠支气管上皮细胞（RTE）和肝癌细胞（H4ⅡE），分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组，比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子，并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组（10μmol／L）和DMSO空白对照组，以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1（AP-1）、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞，分β-NF实验组（10μmol／L）与DMSO空白对照组，比较各组荧光素酶值的变化，分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol／L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达，荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组（161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662，均P〈0．01）。在H4ⅡE中，1、10、100μmol／L的B—NF则促进其表达，荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组（5686±441、13601±746、13978±164比3645±367，均P〈0．01）。荧光定量PCR显示10μmol／L的β-NF作用下，RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0．73倍，在H4ⅡE细胞中则是1．98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后，RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组（P〈0．01），而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组（P〈0．05）。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～＋2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后，转染GCLC—Lue载体的B—NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降（91．50±0．32）％，与之相比，转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少（P〉0．05）。在H4ⅡE，β—NF作用下转染GCLC—Lue载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[（3．81±0．19）倍比（2．08±0．19）倍，P〈0．05]，而与转染NF—κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[（4．41±1．01）倍]相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论在大鼠RTE和H4ⅡE，β—NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE，β—NF通过激活抗氧化应答元件（ARE）类似的AP-1调控GCLC基因表达。 展开更多
关键词 β萘黄酮 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位 谷胱甘肽 细胞特异性
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GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达 被引量：1
3
作者 赖宁 李冰 +3 位作者 王健 付欣 洪玮 冉丕鑫 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期429-435,共7页
研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含... 研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件. 展开更多
关键词 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(gclc) 转录调控 AHR/ARNT元件 大鼠支气管上皮细胞(RTE)
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高氧暴露对早产鼠肺组织HO-1和GCLC表达的影响 被引量：1
4
作者 楚晓云 蔡成 +3 位作者 张潇月 周慧琳 孙俊芳 翁博雯 《中国当代儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期594-600,共7页
目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常... 目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常压空气中饲养,高氧组早产鼠放置在同一室内常压氧箱中(氧浓度85%~95%)饲养,分别于第1、4、7、10、14天,每组取8只大鼠,采集两组早产鼠肺组织标本。采用苏木精-伊红染色法检测两组早产鼠不同时间点肺组织结构的病理变化;采用Westernblot技术和RTqPCR检测两组早产鼠不同时间点肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化。结果 与空气组相比,高氧组早产鼠体重下降显著(P<0.05)。与空气组相比,高氧组早产鼠肺组织病理切片显示肺组织结构紊乱、肺泡间隔增宽、肺泡数目减少和肺泡简单化。高氧组早产鼠肺组织中HO-1mRNA相对表达量在第7天时低于空气组,在第10、14天时高于空气组(P<0.05)。高氧组早产鼠肺组织中GCLCmRNA表达量在第1、4、7天时低于空气组,在第10天时高于空气组(P<0.05)。与空气组比较,高氧组早产鼠肺组织中HO-1蛋白表达水平在各时间点均升高;除第1天外,GCLC蛋白表达水平在其他各时间点均升高(P<0.05)。结论 高氧暴露导致早产鼠生长发育迟缓、肺发育阻滞。早产鼠肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化可能与高氧暴露导致早产鼠肺损伤发病过程相关。 展开更多
关键词 高浓度氧 血红素加氧酶-1 谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位 早产 大鼠
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转录因子上游刺激因子在大鼠不同组织中的分布 被引量：2
5
作者 邹东霆 李冰 +3 位作者 付欣 洪玮 周问渠 冉丕鑫 《广州医学院学报》 2010年第3期28-30,共3页
目的：探讨转录因子上游刺激因子（USF）在大鼠不同正常组织中的分布情况.方法：使用大鼠多种组织构成的组织芯片,免疫组织化学检测USF1、USF2在各组织及其细胞中的表达.结果：USF是体内广泛分布的转录因子,除血管内皮、肾小球细胞外在... 目的：探讨转录因子上游刺激因子（USF）在大鼠不同正常组织中的分布情况.方法：使用大鼠多种组织构成的组织芯片,免疫组织化学检测USF1、USF2在各组织及其细胞中的表达.结果：USF是体内广泛分布的转录因子,除血管内皮、肾小球细胞外在大多数上皮细胞有强的表达.在肌肉组织主要表达于骨骼肌和心肌组织,平滑肌则只有USF2表达;结缔组织中,表达阴性或弱阳性;在卵巢组织中,USF1在发育卵泡和闭锁卵泡均为强阳性表达,USF2则在闭锁卵泡中,强阳性表达,在发育卵泡则表达较弱.结论：USF是大鼠体内广泛分布的转录因子,可能参与调控一般细胞生理活动的基因表达. 展开更多
关键词 转录因子 上游刺激因子 免疫组织化学 谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位 大鼠
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稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立
6
作者 黄楚琴 周问渠 +3 位作者 蔡磊 洪玮 付欣 李冰 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第7期1225-1228,共4页
目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选... 目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P<0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P<0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。 展开更多
关键词 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(gclc) 启动子 荧光素酶报告基因 稳定细胞株
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慈姑多糖对异烟肼/利福平联用致HepG2细胞损伤HO-1和GCLC的影响 被引量：1
7
作者 刘红双 刘文胜 +4 位作者 王晶 张烯 热依拉·吐尔逊 杨亚洁 廖艳 《中华中医药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期4977-4981,共5页
目的:研究慈姑多糖(SSP)对异烟肼(INH)和利福平(RFP)联用致HepG2细胞损伤中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)酶含量、基因及蛋白表达影响。方法:采用ELISA检测HepG2细胞中HO-1和GCLC含量变化;采用定量RT-... 目的:研究慈姑多糖(SSP)对异烟肼(INH)和利福平(RFP)联用致HepG2细胞损伤中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)酶含量、基因及蛋白表达影响。方法:采用ELISA检测HepG2细胞中HO-1和GCLC含量变化;采用定量RT-PCR技术检测HepG2细胞中HO-1、GCLC mRNA的表达;采用Western Blot法检测HepG2细胞中HO-1和GCLC蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,模型组HepG2细胞中HO-1和GCLC含量、mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.05);与模型组比较,SSP最佳给药组中HO-1和GCLC mRNA、蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:SSP可能通过促进HepG2细胞中HO-1及GCLC含量、mRNA及蛋白的表达,发挥其对INH/RFP联用致肝损伤的保护作用。 展开更多
关键词 慈姑多糖 异烟肼/利福平联用 肝保护 血红素加氧酶-1 谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位 机制
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