目的:探讨龟鹿二仙胶含药血清对白细胞介素-1β诱导的膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)小鼠软骨细胞模型自噬和凋亡的影响及作用机制。方法:将10只SD大鼠随机分为龟鹿二仙胶含药血清制备组和空白血清制备组,分别给予龟鹿二仙胶药液...目的:探讨龟鹿二仙胶含药血清对白细胞介素-1β诱导的膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)小鼠软骨细胞模型自噬和凋亡的影响及作用机制。方法:将10只SD大鼠随机分为龟鹿二仙胶含药血清制备组和空白血清制备组,分别给予龟鹿二仙胶药液和生理盐水灌胃,连续灌胃1周后,采集腹主动脉血,制备龟鹿二仙胶含药血清和空白血清。取培养至第2代的C57BL/6小鼠膝关节软骨细胞,分为空白血清组、模型组、龟鹿二仙胶含药血清组。模型组、龟鹿二仙胶含药血清组加入终浓度为10 ng·mL-1的白细胞介素-1β,诱导培养24 h后,空白血清组、模型组加入10%空白血清,龟鹿二仙胶含药血清组加入10%龟鹿二仙胶含药血清,继续培养24 h。采用流式细胞分析仪检测各组软骨细胞凋亡率,采用电子显微镜观察各组软骨细胞自噬小体,分别采用实时定量PCR和Western Blot法检测腺苷一磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、UNC-51样自噬激活激酶1(UNC-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、自噬相关蛋白5(autophagy related protein 5,ATG5)、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13、趋化因子配体2(chemokine ligand 2,CCL2)的mRNA和蛋白表达水平。结果:①软骨细胞凋亡率检测结果。模型组软骨细胞凋亡率高于空白血清组(P=0.000),龟鹿二仙胶含药血清组软骨细胞凋亡率低于模型组(P=0.000)。②软骨细胞自噬小体观察结果。空白血清组可见双层膜封闭的球状自噬小体,模型组自噬小体数量较空白血清组减少,龟鹿二仙胶含药血清组自噬小体数量较模型组增加。③软骨细胞自噬和凋亡相关基因mRNA和蛋白表达水平检测结果。模型组软骨细胞AMPK、ULK-1、ATG5、LC3B、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均低于空白血清组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.002,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000),mTOR、Bax、MMP-13、CCL2的mRNA和蛋白表达水平均高于空白血清组(P=0.002,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.004,P=0.000,P=0.000,P=0.000);龟鹿二仙胶含药血清组软骨细胞AMPK、ULK1、ATG5、LC3B、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均高于模型组(P=0.000,P=0.003,P=0.001,P=0.001,P=0.001;P=0.020,P=0.002,P=0.000,P=0.008,P=0.004),mTOR、Bax、MMP-13、CCL2的mRNA和蛋白表达水平均低于模型组(P=0.008,P=0.001,P=0.000,P=0.000;P=0.040,P=0.000,P=0.001,P=0.000)。结论:龟鹿二仙胶含药血清能够增强KOA软骨细胞自噬,抑制其凋亡与细胞外基质降解,且龟鹿二仙胶含药血清可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路发挥作用。展开更多
文摘目的:探讨龟鹿二仙胶含药血清对白细胞介素-1β诱导的膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)小鼠软骨细胞模型自噬和凋亡的影响及作用机制。方法:将10只SD大鼠随机分为龟鹿二仙胶含药血清制备组和空白血清制备组,分别给予龟鹿二仙胶药液和生理盐水灌胃,连续灌胃1周后,采集腹主动脉血,制备龟鹿二仙胶含药血清和空白血清。取培养至第2代的C57BL/6小鼠膝关节软骨细胞,分为空白血清组、模型组、龟鹿二仙胶含药血清组。模型组、龟鹿二仙胶含药血清组加入终浓度为10 ng·mL-1的白细胞介素-1β,诱导培养24 h后,空白血清组、模型组加入10%空白血清,龟鹿二仙胶含药血清组加入10%龟鹿二仙胶含药血清,继续培养24 h。采用流式细胞分析仪检测各组软骨细胞凋亡率,采用电子显微镜观察各组软骨细胞自噬小体,分别采用实时定量PCR和Western Blot法检测腺苷一磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、UNC-51样自噬激活激酶1(UNC-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、自噬相关蛋白5(autophagy related protein 5,ATG5)、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13、趋化因子配体2(chemokine ligand 2,CCL2)的mRNA和蛋白表达水平。结果:①软骨细胞凋亡率检测结果。模型组软骨细胞凋亡率高于空白血清组(P=0.000),龟鹿二仙胶含药血清组软骨细胞凋亡率低于模型组(P=0.000)。②软骨细胞自噬小体观察结果。空白血清组可见双层膜封闭的球状自噬小体,模型组自噬小体数量较空白血清组减少,龟鹿二仙胶含药血清组自噬小体数量较模型组增加。③软骨细胞自噬和凋亡相关基因mRNA和蛋白表达水平检测结果。模型组软骨细胞AMPK、ULK-1、ATG5、LC3B、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均低于空白血清组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.002,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000),mTOR、Bax、MMP-13、CCL2的mRNA和蛋白表达水平均高于空白血清组(P=0.002,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.004,P=0.000,P=0.000,P=0.000);龟鹿二仙胶含药血清组软骨细胞AMPK、ULK1、ATG5、LC3B、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均高于模型组(P=0.000,P=0.003,P=0.001,P=0.001,P=0.001;P=0.020,P=0.002,P=0.000,P=0.008,P=0.004),mTOR、Bax、MMP-13、CCL2的mRNA和蛋白表达水平均低于模型组(P=0.008,P=0.001,P=0.000,P=0.000;P=0.040,P=0.000,P=0.001,P=0.000)。结论:龟鹿二仙胶含药血清能够增强KOA软骨细胞自噬,抑制其凋亡与细胞外基质降解,且龟鹿二仙胶含药血清可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路发挥作用。
