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双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒
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作者 邓迎春 郭旭光 +3 位作者 牛会敏 任宝红 韩小改 郭瑞 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期151-157,共7页
目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型... 目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。 展开更多
关键词 荧光逆转录-聚合链式反应 恒温荧光逆转录-重组酶介导等温扩增 GⅠ型诺如病毒 GⅡ型诺如病毒
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逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒 被引量:29
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作者 侯义龙 张开春 +3 位作者 胡文玉 吴禄平 林珂 尹淑萍 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期71-73,共3页
为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹... 为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。 展开更多
关键词 逆转录-聚合链式反应 优化 果树病毒 检测 RNA病毒
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逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒 被引量:32
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作者 陈信忠 苏亚玲 +3 位作者 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期202-207,共6页
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4~8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-P... 神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4~8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。 展开更多
关键词 石斑鱼 神经坏死病毒 逆转录聚合链式反应
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逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”李矮缩病毒 被引量:1
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作者 侯义龙 于亚军 +2 位作者 张立娟 赵洋 于大永 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期626-627,共2页
为选择不携带主要病毒的植株,利用作者已建立的PDVRT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带PDV的情况进行了调查,结果表明,被检植株PDV的感染率达90%,但程度不同。
关键词 逆转录-聚合链式反应 PDV 检测
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荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA 被引量:4
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作者 朱方成 蔡成忠 +3 位作者 王树法 刘良 任亮 朱少华 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1628-1630,共3页
目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,P... 目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 死亡时间(PMI) 荧光半定量技术 逆转录-聚合链式反应(RT-PCR) 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)
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逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒 被引量:7
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作者 曾地刚 雷爱莹 《广西农业科学》 CSCD 2006年第6期735-737,共3页
用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。
关键词 罗氏沼虾 诺达病毒 逆转录聚合链式反应
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利用逆转录酶的聚合酶链式反应检测外周血中的肿瘤细胞 被引量:1
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作者 李婧 《生命的化学》 CAS CSCD 2002年第5期488-490,共3页
本文就RT-PCR技术检测外周血中肿瘤细胞的基本原理及其在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等检测中的应用加以综述。
关键词 逆转录 聚合链式反应 检测 外周血 肿瘤细胞 RT-PCR
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逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”主要病毒 被引量:2
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作者 侯义龙 《生物技术》 CAS CSCD 2005年第6期42-43,共2页
目的:调查“歇马杏”携带主要病毒的情况。方法:利用作者已建立的ACLSV、PNRSV和PDV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带三种病毒的情况进行了调查。结果:被检植株ACLSV、PNRSV和PDV的单独感染率分别为83.33%... 目的:调查“歇马杏”携带主要病毒的情况。方法:利用作者已建立的ACLSV、PNRSV和PDV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带三种病毒的情况进行了调查。结果:被检植株ACLSV、PNRSV和PDV的单独感染率分别为83.33%、83.33%和90%,复合感染率达到76.67%,但带毒程度不同。 展开更多
关键词 逆转录-聚合链式反应 苹果绿叶斑病毒 李属坏死环斑病毒 李矮缩病毒 检测
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逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测石斑鱼神经坏死病毒方法的建立和应用 被引量:2
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作者 龚艳清 陈信忠 《检验检疫科学》 2004年第B12期53-56,共4页
神经坏死病毒是导致石斑鱼等多种海水鱼类暴发性传染病的致病原。根据石斑鱼神经坏死病毒编码核衣壳蛋白的RNA2基因组序列设计的一对特异性引物,用来扩增其中的421bp病毒核酸片段。比较了酚-氯仿法、试剂盒法等3种RNA抽提的方法对神经... 神经坏死病毒是导致石斑鱼等多种海水鱼类暴发性传染病的致病原。根据石斑鱼神经坏死病毒编码核衣壳蛋白的RNA2基因组序列设计的一对特异性引物,用来扩增其中的421bp病毒核酸片段。比较了酚-氯仿法、试剂盒法等3种RNA抽提的方法对神经坏死病毒的核酸抽提效果,结果表明3种方法均适合于RT-PCR方法。实验证明在cDNA过程中,RNA酶抑制剂并非反应所必需。对RT-PCR过程进行了条件优化,建立了一步法的RT-PCR检测方法,在网箱养殖石斑鱼以及育苗场的病鱼检测实践中获得满意效果。 展开更多
关键词 逆转录聚合链式反应 石斑鱼 神经坏死病毒 鱼苗 RNA酶抑制剂 核酸 酚/氯仿法
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实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌
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作者 张冲 刘祥 陈计峦 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期170-175,共6页
针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反... 针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。 展开更多
关键词 逆转录聚合链式反应 金黄色葡萄球菌 死活菌 普通聚合链式反应
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用逆转录多聚酶链式反应从凡纳对虾中检出传染性皮下组织和造血器官坏死病毒 被引量:13
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作者 刘荭 高隆英 +1 位作者 史秀杰 江育林 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期185-188,共4页
A reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) was used for detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) from the gills and subcutaneous tissue of Penaeus vannamei (10-15cm ... A reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) was used for detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) from the gills and subcutaneous tissue of Penaeus vannamei (10-15cm in body size) without clinical signs. With primers 77012R and 77353F, a fragment of 356bp of IHHNV was amplified in RT PCR. The amplified product was sequenced and showed more than 98% homologue with the sequences of other IHHNV strains in Gene Bank. 展开更多
关键词 传染性 皮下组织 造血器官 坏死病毒 凡纳对虾 逆转录多聚酶 链式反应 高密度养殖 核酸抽取 PCR产物
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基于阳离子共轭聚合物荧光共振能量转移结合杂交链式反应信号扩增检测端粒酶活性 被引量:3
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作者 周晓毓 赵建伟 +1 位作者 马贵敏 贾红霞 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1006-1013,共8页
检测端粒酶活性对肿瘤、癌症的早期诊断,以及开发以端粒酶为靶标分子的抗肿瘤、抗癌药物具有重要意义。本研究基于阳离子共轭聚合物Poly[(9,9-bis(6'-N,N,N-trimethylammonium)hexyl)fluorenylene phenylene(PFP)与荧光染料SYBRGree... 检测端粒酶活性对肿瘤、癌症的早期诊断,以及开发以端粒酶为靶标分子的抗肿瘤、抗癌药物具有重要意义。本研究基于阳离子共轭聚合物Poly[(9,9-bis(6'-N,N,N-trimethylammonium)hexyl)fluorenylene phenylene(PFP)与荧光染料SYBRGreenI(SG)之间的荧光共振能量转移,建立了一种简单快速的端粒酶活性检测方法。当端粒酶存在时,引物探针被延伸,生成具有-(GGTTAG)n重复序列的DNA。然后通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上。加入与端粒酶延伸产物匹配的探针-(CTAACC)2。端粒酶延伸产物形成双链结构之后加入SG,SG能够特异性的嵌入到DNA双链结构中。最后,加入PFP。PFP是一种带有正电荷的水溶性共轭阳离子聚合物,可以通过静电作用与双链DNA发生吸附。PFP与嵌入在双链结构中的SG发生荧光共振能量转移(FRET)。根据FRET的效率可以实现对端粒酶活性的定量检测。本方法可以检测到3.0×10^5个Hela细胞中提取的端粒酶活性。将本方法与杂交链式反应(HCR)反应结合,可实现检测信号的放大,提高检测的灵敏度,可以检测到6.0×10^4个Hela细胞中的端粒酶活性,灵敏度提高了一个数量级。本方法简单、快速,无需标记、扩增过程,无酶参与,检测成本低,灵敏度高。 展开更多
关键词 端粒酶 活性 阳离子共轭聚合物 荧光共振能量转移 杂交链式反应 无酶信号放大
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小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立 被引量:7
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作者 袁文 刘忠华 +2 位作者 张钰 刘香梅 黄韧 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2009年第5期354-359,I0007,I0008,共8页
目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因... 目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。 展开更多
关键词 小鼠肝炎病毒 逆转录环介导等温扩增 逆转录聚合链式反应
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实时RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶mRNA用于乳腺癌鉴别诊断及与c-Myc基因的相关性 被引量:3
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作者 唐峰 陈忠清 +5 位作者 包芸 朱腾芳 王虹 朱虹光 许祖德 胡锡琪 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期727-731,共5页
目的探讨定量检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值,并观察原癌基因c-Myc与hTERT mRNA表达的关系。方法收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例,采用实时荧光定... 目的探讨定量检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值,并观察原癌基因c-Myc与hTERT mRNA表达的关系。方法收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例,采用实时荧光定量RT-PCR技术(Real-ti me RT-PCR)定量检测hTERT和c-Myc基因的转录水平。结果以NhTERT=10为临界值,所有正常组织和良性病变NhTERT值均小于临界值,而hTERT基因转录升高的导管原位癌及浸润性导管癌其NhTERT值均大于此临界值。显示hTERT和c-Myc基因转录水平呈正相关(γ=0.7395,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR技术检测hTERT基因表达具有高敏感性和特异性,能为常规病理学诊断提供客观的参考指标,从而提高乳腺不典型导管增生与导管原位癌鉴别诊断的准确性。原癌基因c-Myc转录水平上调可能与乳腺癌hTERT基因转录激活有关。 展开更多
关键词 乳腺癌 端粒酶 实时荧光定量逆转录聚合链式反应 人端粒酶逆转录 C-MYC原癌基因
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重组逆转录病毒质粒pLNCX/iNOS的构建 被引量:4
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作者 朱梁军 潘英 陈宝安 《江苏医药》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期26-28,共3页
目的 构建含一氧化氮合酶 (iNOS)基因的重组逆转录病毒 pLNCX/iNOS质粒。 方法 用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长DNA ,用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ对i NOSDNA和逆转录病毒质粒pLNCX分别进行双酶切。在T4连接酶的作用下 ,构... 目的 构建含一氧化氮合酶 (iNOS)基因的重组逆转录病毒 pLNCX/iNOS质粒。 方法 用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长DNA ,用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ对i NOSDNA和逆转录病毒质粒pLNCX分别进行双酶切。在T4连接酶的作用下 ,构建重组逆转录病毒质粒 pLNCX/iNOS ;用脂质体介导的方法把重组质粒DNA转染进入包装细胞PA317中 ,经过G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒液的病毒滴度。结果 经过酶切分析证实PCR扩增的iNOSDNA基因序列与鼠源性iNOS基因序列完全一致。重组质粒经酶切分析与预期的结果一致。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 1× 10 4 CFU/ml。结论 逆转录病毒载体 展开更多
关键词 一氧化氮合酶 逆转录病毒 基因转染 聚合链式反应 肿瘤
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逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段 被引量:2
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作者 王勇 郎刚华 +1 位作者 刘宗柱 张培军 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期31-36,共6页
于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品,采用RT-PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明,用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物,用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进... 于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品,采用RT-PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明,用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物,用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现,用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想,而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下,用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时,三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。 展开更多
关键词 文昌鱼 LIM类同源框基因 逆转录-聚合链式反应
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检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立 被引量:1
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作者 张锦海 陈幸华 +5 位作者 李波 赵国良 张曦 孔佩艳 彭贤贵 刘林 《重庆医学》 CAS CSCD 2005年第12期1812-1814,共3页
目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR... 目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。 展开更多
关键词 急性髓性白血病 多药耐药基因 多重逆转录聚合酶链反应 半巢式多重聚合链式反应
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直接逆转录原位PCR检测实验性汉坦病毒感染乳鼠脑组织中病毒RNA及其与原位分子杂交的比较
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作者 杨守京 刘彦仿 +1 位作者 贺宏印 刘俊彬 《中国组织化学与细胞化学杂志》 CAS CSCD 1997年第4期29-36,共8页
出生后2~3d的昆明种乳鼠,经腹腔接种100个半数致死量的陈株汉坦病毒,每只0.05ml,于接种后1、2、4、6、8、10、12、14d处死动物,每个时间点3~6只不等,取其脑组织固定于4%的多聚甲醛中,石蜡包埋制备... 出生后2~3d的昆明种乳鼠,经腹腔接种100个半数致死量的陈株汉坦病毒,每只0.05ml,于接种后1、2、4、6、8、10、12、14d处死动物,每个时间点3~6只不等,取其脑组织固定于4%的多聚甲醛中,石蜡包埋制备5μm的连续组织切片,每时间点取1~2例组织切片,用逆转录原位PCR(RT-ISPCR)方法检测组织中病毒S片段RNA,组织脱蜡后,经DNase、蛋白酶K、消化等予处理,用汉坦病毒RNAS片段特异的一对引物,在组织切片上进行病毒RNA的逆转录和PCR过程,直接将digoxigenin-11-dUTP掺入到扩增产物中,经过30个PCR循环后,用碱性磷酸酶标记的抗digoxigenin抗体免疫组化检测扩增产物,连续组织切片用digoxigenin标记的汉坦病毒M片段G2编码区RT-PCR扩增产物的和S片段特异性探针进行原位分子杂交并与RT-ISPCR结果进行比较,另外应用免疫组化检测该基因表达产物病毒核抗原(NP),结果,RT-ISPCR在病毒感染1d的乳鼠脑组织中检测到病毒RNA扩增产物,扩增产物定位于神经细胞胞浆内,而原位分子杂交和免疫组化检测阴性。在病毒感染2d及2d以后的乳鼠脑组织中RT-I? 展开更多
关键词 汉坦病毒 逆转录原位聚合链式反应 原位杂交 小鼠
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单向聚合酶链式反应扩增法研究 被引量:1
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作者 高晋华 高文华 《科技情报开发与经济》 2000年第3期35-36,共2页
:c DNA的末端快速扩增 (RACE)是获得全长 c DNA的有效手段之一。本文论述了 RACE技术的原理、方法和改进 ,并介绍了新型 RACE技术。
关键词 RACE 扩增 逆转录 DNA 单向聚合链式反应 末端快速扩增
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一步法逆转录荧光定量PCR检测食源性沙门氏菌 被引量:4
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作者 周晓清 李苗云 +5 位作者 刘杰 赵改名 柳艳霞 田玮 黄现青 高晓平 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第12期182-188,共7页
建立采用一步法逆转录荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测食源性沙门氏菌的检测方法并初步应用。以沙门氏菌的invA基因为目的基因设计引物,优化PCR反应体系和反应条件,同时进行特异性、灵敏度和重复性实验;并用所建立的方法检测人工污染... 建立采用一步法逆转录荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测食源性沙门氏菌的检测方法并初步应用。以沙门氏菌的invA基因为目的基因设计引物,优化PCR反应体系和反应条件,同时进行特异性、灵敏度和重复性实验;并用所建立的方法检测人工污染的猪肉样品,通过与传统计数方法的结果对比验证所建立方法的适用性。优化后的逆转录荧光定量PCR检测条件为:42℃、5min,95℃、10s,95℃、5s,67℃、34s;此步骤进行40个循环;上、下游引物的最佳终浓度均为0.16μmol/L。结果表明:该方法的特异性为100%;重复性良好;对沙门氏菌的检测下限为150CFU/mL;检测人工污染食品样品的结果100%符合传统计数结果。建立的检测方法具有快速、灵敏、简单等特点,非常适用于食源性沙门氏菌的检测。 展开更多
关键词 沙门氏菌 RNA 逆转录荧光定量聚合链式反应
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