用于通路(Gateway)克隆技术的植物表达载体研究进展 被引量：6

1

作者 肖素勤 孙振 +1 位作者 轩秀霞 陈丽梅 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期528-544,共17页

通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术。利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间。... 通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术。利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间。为了扩大Gateway技术在植物基因工程领域的应用,最近有很多研究机构和研究小组开发了能用于组成型或诱导型表达目的基因、基因沉默、启动子分析、蛋白质亚细胞定位、蛋白质/蛋白质相互作用、多个DNA片段的模块化组装和DNA组片段功能验证等研究用的植物表达载体。该文对这些技术的研究进展进行了综述。 展开更多

关键词 通路克隆技术 植物表达载体 载体结构 LR反应 重组位点

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使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆 被引量：10

2

作者 陈其军 安瑞 +2 位作者 周海梦 陈珈 王学臣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第10期951-954,共4页

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与... 与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合 ,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体 ,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆 .利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题 . 展开更多

关键词 gateway克隆技术 TA克隆技术 入门载体 T载体 入门克隆

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利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子 被引量：19

3

作者 梅文倩 宋文强 +2 位作者 潘怡 巩威 朱玉贤 《分子植物育种》 CAS CSCD 2004年第3期358-364,共7页

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体... 随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和West-ern-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。 展开更多

关键词 gateway克隆技术 拟南芥 转录因子 聚类分析 功能基因组

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通路克隆系统:DNA重组技术的新进展 被引量：12

4

作者 汪宗桂 郑文岭 马文丽 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第7期24-27,共4页

近几年新发展了一种载体间DNA片段相互灵活转化的多功能系统 ,即通路克隆系统(gatewaycloningsystem)。它是一种位点特异的DNA重组技术 ,包括PCR产物的定向克隆 ,DNA片断高效、广泛的亚克隆 ,氨基或羧基末端的融合蛋白表达等。重点阐述... 近几年新发展了一种载体间DNA片段相互灵活转化的多功能系统 ,即通路克隆系统(gatewaycloningsystem)。它是一种位点特异的DNA重组技术 ,包括PCR产物的定向克隆 ,DNA片断高效、广泛的亚克隆 ,氨基或羧基末端的融合蛋白表达等。重点阐述了该系统的作用原理、特点及其应用。 展开更多

关键词 通路克隆系统 DNA重组技术 载体 定向克隆 亚克隆

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小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建 被引量：2

5

作者 李明 丁博 +5 位作者 牛有雄 吕芳芳 杨文丽 Silin Zhong 孙守钧 谢晓东 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期17-22,共6页

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守... 以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用Gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 小麦 WRKY转录因子 gateway克隆技术 可诱导表达载体

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转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体 被引量：6

6

作者 佟友丽 赵飞 +1 位作者 冯君伟 李玉花 《生物技术通讯》 CAS 2007年第2期205-208,共4页

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求... 目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。 展开更多

关键词 转录因子DREB1A gateway克隆技术 植物表达载体

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利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

7

作者 马宁 董晓燕 +2 位作者 姜艳芳 刘蒙蒙 刘子玲 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期898-903,I0004,共7页

目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码... 目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES-hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果:人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论:成功构建重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。 展开更多

关键词 Hiwi基因 腺病毒 重叠延伸聚合酶链反应 gateway克隆技术

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花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体 被引量：4

8

作者 韩占品 任健 +2 位作者 于玮玮 范夕玲 李慧 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1128-1134,共7页

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物... 【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 花椰菜 ERF114 AP2/ERF gateway克隆技术 生物信息学

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通路克隆入门载体pEN-L4＊-PrbcS-＊T-gfp-L3＊的构建及其应用 被引量：1

9

作者 肖素勤 孙振 +5 位作者 王莎莎 梁锋 李莉 年洪娟 李昆志 陈丽梅 《生命科学研究》 CAS CSCD 2011年第6期476-484,共9页

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ... 为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台. 展开更多

关键词 pEN-L4＊-PrbcS-＊T-gfp-L3＊入门载体 通路克隆(gateway)技术 光诱导型启动子 植物表达载体 叶绿体定位

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利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体 被引量：3

10

作者 王聪颖 陈书霞 +5 位作者 陈巧 郝丽宁 孟焕文 万旭花 申晓青 程智慧 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期152-158,共7页

为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因(HPL)下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响,设计1对特异引物,以黄瓜pDONR201-HPL质粒为模板,通过PCR扩增出323bp的片段。利用基于同源重组原理的Gateway技术,将扩增的片段通过BP反应连接到入... 为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因(HPL)下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响,设计1对特异引物,以黄瓜pDONR201-HPL质粒为模板,通过PCR扩增出323bp的片段。利用基于同源重组原理的Gateway技术,将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201中。对扩增出的323bp的片段进行测序,测序结果显示该序列与原序列同源性为100%。在此基础上,通过LR反应将目的片段插入过表达的植物RNA干涉载体pHellsgate8,构建黄瓜HPL基因的RNAi表达载体pHellsgate8-HPLi,分别经限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ酶切后获得323bp的片段,与预期结果一致。采用热击法将pHellsgate8-HPLi转化农杆菌GV3101,经菌液PCR扩增获得323bp的目的条带,表明RNAi表达载体pHellsgate8-HPLi已成功转入农杆菌中。 展开更多

关键词 黄瓜 HPL基因 RNAi干扰 克隆载体 表达载体 gateway技术

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利用Gateway技术构建重组腺病毒载体pAd-LMP-1 被引量：4

11

作者 顾洪生 程志安 +2 位作者 李振宇 周文钰 邹小英 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第24期4425-4429,共5页

背景:目前大多采用Adeasy系统来构建和包装腺病毒载体,整个过程需要多次酶切,连接和转化筛选,并且在BJ183菌中的重组阳性率很低,还可能存在假阳性的可能,整个过程耗时、繁琐。目的:应用Gateway技术较快速构建大鼠LIM矿化蛋白1基因重组... 背景:目前大多采用Adeasy系统来构建和包装腺病毒载体,整个过程需要多次酶切,连接和转化筛选,并且在BJ183菌中的重组阳性率很低,还可能存在假阳性的可能,整个过程耗时、繁琐。目的:应用Gateway技术较快速构建大鼠LIM矿化蛋白1基因重组腺病毒载体。方法:从SD大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1,转化TOP10细菌后挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacⅠ内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。将目的基因与Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)一致性BLAST比较,并观察重组腺病毒载体pAd-LMP-1的表达。.结果与结论:总RNA后电泳结果显示所提RNA完整,RNA纯度符合要求。成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序证明,目的基因与Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)作BLAST比较,发现系列一致,没有突变。构建出来的腺病毒载体载体能在293A细胞中包装成功。提示利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单、快捷地获得pAd-LMP-1。 展开更多

关键词 重组腺病毒载体 LIM矿化蛋白 gateway技术 克隆 大鼠

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含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用(英文) 被引量：3

12

作者 马莉 宋中邦 +5 位作者 胡清泉 赵玥 年洪娟 玉永雄 李昆志 陈丽梅 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第3期269-279,共11页

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR... Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中. 展开更多

关键词 通路克隆技术 1 5二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3C启动子 入门载体 植物表达载体 叶绿体定位

原文传递

利用一步克隆方法快速高效构建Gateway入门载体

13

作者 张艳军 赵利 +2 位作者 李雨佳 赵江哲 张可伟 《浙江师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2020年第1期72-76,共5页

Gateway技术是一种非常便捷的载体构建方法,但目前构建入门克隆的方法成本较高,且存在一定的局限性.利用限制酶Eco RⅠ对pCR8-AtS5H入门克隆进行单酶切,获得入门载体pCR8片段,然后利用不依赖序列和连接的一步克隆方法(one-step sequence... Gateway技术是一种非常便捷的载体构建方法,但目前构建入门克隆的方法成本较高,且存在一定的局限性.利用限制酶Eco RⅠ对pCR8-AtS5H入门克隆进行单酶切,获得入门载体pCR8片段,然后利用不依赖序列和连接的一步克隆方法(one-step sequence-and ligation-independent cloning,One-SLIC)将纯化后水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1 pro)片段连接至pCR8入门载体,并通过菌落PCR和测序方法鉴定得到阳性入门克隆,最后通过LR重组反应将ICS1 pro片段转移至Gateway目的载体pMDC163上.这种利用One-SLIC法快速高效构建入门克隆的方法操作简便,成功率高且成本低,是一种具有广泛应用前景的Gateway入门载体构建方法. 展开更多

关键词 入门克隆 SLIC技术 gateway LR重组反应

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基于Gateway技术的植物表达载体的构建 被引量：9

14

作者 郭姗姗 张蒙 单卫星 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2010年第11期161-166,172,共7页

【目的】为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达... 【目的】为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体。【方法】分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连入根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试。【结果】成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达。【结论】基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆。 展开更多

关键词 gateway技术 植物表达载体 瞬时表达 功能克隆

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基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建生物技术科学 被引量：2

15

作者 胡金艳 张书祥 +1 位作者 王晓武 武剑 《中国农学通报》 CSCD 2007年第12期45-48,共4页

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway... 随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。 展开更多

关键词 gateway克隆技术 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 雄性不育 GHF基因 表达载体

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T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统（英文） 被引量：1

16

作者 朱晓博 张贵粉 +3 位作者 王友梅 Staffan Persson 谢国生 王令强 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期341-350,共10页

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵... Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点"core attL"的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入p MD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到p MD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。 展开更多

关键词 gateway克隆技术 直接LR反应 序列比对 特异位点

原文传递

乳酸杆菌组成型启动子探测载体pgateway-612的构建 被引量：2

17

作者 陈家锃 崔红玉 +4 位作者 田志军 葛俊伟 安同庆 彭金美 李一经 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期849-853,共5页

为筛选适宜乳酸菌(LAB)宿主表达载体的启动子,本研究以大肠杆菌-LAB穿梭载体pPG612为基本骨架,利用GatewayTM克隆技术操作构建了LAB组成型启动子探测载体,并利用该载体筛选了短乳杆菌的S层启动子。我们利用底物X-gluC与报告基因gusA编... 为筛选适宜乳酸菌(LAB)宿主表达载体的启动子,本研究以大肠杆菌-LAB穿梭载体pPG612为基本骨架,利用GatewayTM克隆技术操作构建了LAB组成型启动子探测载体,并利用该载体筛选了短乳杆菌的S层启动子。我们利用底物X-gluC与报告基因gusA编码的蛋白酶之间的特异性显色反应筛选阳性菌落,超声破碎后的菌体蛋白经SDS-PAGE和western blot分析表明该启动子在宿主菌中具有组成型启动子活性。本研究为进一步利用表达载体及筛选其他LAB启动子奠定基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 启动子探测载体 gateway克隆技术 X-gluC

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大豆花叶病毒HC-Pro基因保守序列克隆及其RNAi载体的构建 被引量：2

18

作者 高乐 宋英培 +4 位作者 李凯 章红运 沈颖超 翟锐 智海剑 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期744-749,共6页

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,严重危害大豆的产量和品质。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能够在mRNA水平特异性沉默同源靶基因,为抗病毒作物的培育提供了新的途径。本研究对国内外11个不同SM... 大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,严重危害大豆的产量和品质。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能够在mRNA水平特异性沉默同源靶基因,为抗病毒作物的培育提供了新的途径。本研究对国内外11个不同SMV流行株系的HC-Pro基因进行了核苷酸序列比对,并以SC3株系的cDNA为模板克隆出高度保守的268 bp的基因片段,进而利用GATEWAY技术构建了适合农杆菌介导大豆转化的RNAi表达载体pB7GWIWG2(II)-HC-Proi。并对BP反应和LR反应的纯化产物进行了测序鉴定,测得序列在NCBI上进行比对,匹配度为100%;以35S启动子和终止子设计引物,扩增得到464和478 bp两个片段,说明HC-Proi基因与pB7GWIWG2(II)重组形成反向重复结构,载体构建成功。结果为利用RNA干扰技术改良大豆对大豆花叶病毒的抗性奠定了基础。 展开更多

关键词 大豆花叶病毒 HC—Pro基因 克隆 RNAI gateway技术 载体构建

原文传递

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建 被引量：1

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作者 郭新红 邓克勤 +1 位作者 姜泽海 刘选明 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2006年第22期5800-5801,5831,共3页

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,... 根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。 展开更多

关键词 拟南芥 AtPP2C基因 gateway克隆技术 植物表达载体构建

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葡萄糖转运蛋白5低表达对骨肉瘤MG-63细胞系克隆形成能力和迁移能力的影响及其可能机制 被引量：1

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作者 沈朝 刘树江 +2 位作者 苑萌萌 吴文杰 李志强 《广西医学》 CAS 2021年第4期459-463,483,共6页

目的分析抑制葡萄糖转运蛋白5(Glut5)的表达对骨肉瘤MG-63细胞系克隆形成能力和迁移能力的影响,并基于Wnt/β-连环蛋白信号通路探讨其可能的作用机制。方法取对数生长期的MG-63细胞分为Con组、NC组和短发夹RNA(shRNA)-Glut5组。Con组未... 目的分析抑制葡萄糖转运蛋白5(Glut5)的表达对骨肉瘤MG-63细胞系克隆形成能力和迁移能力的影响,并基于Wnt/β-连环蛋白信号通路探讨其可能的作用机制。方法取对数生长期的MG-63细胞分为Con组、NC组和短发夹RNA(shRNA)-Glut5组。Con组未进行基因干扰,NC组和shRNA-Glut5组则采用RNA干扰技术将杂序的shRNA、shRNA-Glut5分别转染至MG-63细胞。转染48 h后,检测3组细胞的增殖能力、细胞克隆数和迁移能力,以及细胞中Glut5、β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和基质金属蛋白酶3(MMP3)的mRNA和蛋白的表达水平。结果与其他两组比较,shRNA-Glut5组MG-63细胞的增殖和迁移能力下降,细胞克隆数减少,Glut5、β-连环蛋白、cyclinD1和MMP3的mRNA和蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。结论下调Glut5基因表达可以抑制骨肉瘤MG-63细胞系的增殖、克隆形成和迁移能力,Wnt/β-连环蛋白信号通路可能参与调控该过程。 展开更多

关键词 骨肉瘤 MG-63细胞系 葡萄糖转运蛋白5 Wnt/β-连环蛋白信号通路 细胞克隆 细胞迁移 RNA干扰技术

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