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乳铁蛋白的重组表达系统及法规管理现状概述
1
作者 吴晓文 张长太 +2 位作者 李佳佳 凡孝菊 周景文 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期321-329,共9页
乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的乳汁和黏膜分泌物当中。乳铁蛋白具有广谱抑菌、抗病毒、免疫调节等生理功能,在婴幼儿配方乳粉、营养补充剂、化妆品等领域都有应用。近年来,随着基因工程技术的不断发展,来自不同物种... 乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的乳汁和黏膜分泌物当中。乳铁蛋白具有广谱抑菌、抗病毒、免疫调节等生理功能,在婴幼儿配方乳粉、营养补充剂、化妆品等领域都有应用。近年来,随着基因工程技术的不断发展,来自不同物种的乳铁蛋白在常见的原核体系、真核体系与转基因哺乳动物中均得到了成功表达,重组产物的表达量及其与天然乳铁蛋白的结构相似度也在不断提升。该文对乳铁蛋白的生物学活性、重组表达系统以及目前的法规管理情况进行综述,并讨论了重组乳铁蛋白的研究难点和未来发展方向。 展开更多
关键词 乳铁蛋白 生理活性 重组表达系统 法规 应用
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豇豆血红蛋白Lb Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达条件优化、纯化与鉴定 被引量：3
2
作者 刘萌 王聪睿 +1 位作者 刘波 赵祥忠 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第4期163-170,共8页
豇豆根瘤中含有大量豆血红蛋白。该蛋白是良好的天然色素,可用于人造肉的着色,本文将携带豇豆血红蛋白Lb Ⅱ基因的质粒p ET-15b转化进入大肠杆菌BL21中表达,并对表达条件进行优化。通过查找NCBI数据库得到一条全长456 bp的豇豆血红蛋白... 豇豆根瘤中含有大量豆血红蛋白。该蛋白是良好的天然色素,可用于人造肉的着色,本文将携带豇豆血红蛋白Lb Ⅱ基因的质粒p ET-15b转化进入大肠杆菌BL21中表达,并对表达条件进行优化。通过查找NCBI数据库得到一条全长456 bp的豇豆血红蛋白Lb Ⅱ的序列,以p ET-15b作为表达载体,大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-R-IL作为重组工程菌进行表达,成功表达出豇豆血红蛋白Lb Ⅱ,并使用镍柱层析对蛋白进行初步纯化,同时添加抗坏血酸为抗氧化剂。以IPTG浓度、温度、时间为自变量,Lb Ⅱ表达量为因变量进行单因素实验。结果表明,在IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为25℃,时间为14 h时,重组豆血红蛋白Lb Ⅱ的表达量最高,经SDS-PAGE凝胶电泳和可见光光谱分析法鉴定为目的蛋白Lb Ⅱ。经响应面试验优化后,表达量可以达到7.30μg/m L。本研究为后续使用工程菌发酵生产豆血红蛋白奠定了基础。 展开更多
关键词 豇豆 血红蛋白 响应面优化 重组表达
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别藻蓝蛋白β亚基基因在莱茵衣藻中重组表达及其对光能传递的影响研究 被引量：1
3
作者 徐晓婷 臧晓南 +5 位作者 章峰 尚孟慧 李瑞 毕莹 赵悦 马艺宁 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期77-88,共12页
为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)... 为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m^(-2)·s^(-1))和低光(25μmol·m^(-2)·s^(-1))条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示:实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)位置处的荧光峰均显著高于对照莱茵衣藻藻株CC-849,绿光中PSⅡ荧光峰(波长为690 nm)显著高于对照藻株;高光与低光和白光与绿光条件下转基因藻株的光系统Ⅱ的表观电子传递速率(ETRPSⅡ)值均高于对照藻株,但生物量并未见明显提高。这些结果表明转基因莱茵衣藻中可能存在自重组别藻蓝蛋白到光系统核心的光能传递,但是吸收的光能没有达到促进生物量积累的作用。本研究为利用重组表达蓝藻藻胆蛋白提高异源类囊体膜的光合作用进行了尝试。 展开更多
关键词 别藻蓝蛋白β亚基 钝顶节旋藻 莱茵衣藻 重组表达 光能传递
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枯草芽胞杆菌重组表达的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的研究
4
作者 赵文冲 吴敬 +1 位作者 张康 陈晟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第23期9-15,共7页
异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,具有多种优秀的生理功能,广泛应用于食品行业。蔗糖异构酶可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖,与其他微生物来源的蔗糖异构酶相比,Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶转化蔗糖时异麦芽酮糖产率高,副产物少... 异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,具有多种优秀的生理功能,广泛应用于食品行业。蔗糖异构酶可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖,与其他微生物来源的蔗糖异构酶相比,Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶转化蔗糖时异麦芽酮糖产率高,副产物少。为了更好地将异麦芽酮糖应用于食品领域,该研究将P.dispersa来源的蔗糖异构酶在食品安全微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中重组表达,研究重组蔗糖异构酶的酶学性质并优化其制备异麦芽酮糖的反应条件。结果表明,重组酶的最适pH值为6.0,最适温度为30℃,在pH 5.0~8.0稳定性良好,在45℃下的半衰期为68 min。用该重组酶制备异麦芽酮糖,当蔗糖质量浓度为400 g/L,加酶量为20 U/g,在30℃、pH 6.0条件下转化10 h时,异麦芽酮糖产率可达90.61%,当蔗糖质量浓度提高到700 g/L,异麦芽酮糖产率仍可达89.20%。该研究提高了蔗糖异构酶的安全特性,实现了异麦芽酮糖的高产率,为工业生产异麦芽酮糖奠定了基础。 展开更多
关键词 异麦芽酮糖 蔗糖异构酶 枯草芽胞杆菌 重组表达 酶学性质 酶转化
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赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化
5
作者 朱奕 徐名强 +1 位作者 任燕娜 蔡孟浩 《华东理工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期702-711,共10页
首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌... 首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3_PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT(二硫苏糖醇),并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明:重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的比酶活为10.2 U/mg,且对于门冬胰岛素前体的酶切转化率可达93.5%。 展开更多
关键词 赖氨酰内切酶 重组表达 复性 纯化 活性
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人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析
6
作者 蔡思泽 王斌 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2023年第3期129-137,共9页
胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-CO... 胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。 展开更多
关键词 胶原蛋白 毕赤酵母 重组表达 抗氧化
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钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆、分析及重组表达蛋白荧光活性的研究
7
作者 毕莹 郭雅琳 +2 位作者 尚孟慧 徐晓婷 臧晓南 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期61-70,共10页
为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1056 bp,由apcA和apcB... 为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin_like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,两株重组菌株在640 nm处均出现了别藻蓝蛋白特征荧光发射峰。这些结果表明在重组大肠杆菌中表达的脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基可以和藻蓝胆素结合,形成有光学活性的别藻蓝蛋白,这为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药、荧光检测方面的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 节旋藻 别藻蓝蛋白基因 重组表达 荧光活性
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分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性
8
作者 杨文韬 庞立 +3 位作者 田红 陈晓 易有金 夏菠 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第22期190-199,共10页
目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进... 目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2, IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时, Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶4℃储存10d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。 展开更多
关键词 分散泛菌 N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶 重组表达 酶学特性
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液化沙雷氏菌ZS6脂肪酶的重组表达及功能分析
9
作者 马昀灏 张增平 +1 位作者 杨支力 刘建华 《浙江海洋大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第5期409-414,共6页
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)在日常生活及工业生产中涉及油脂处理的方面有着广泛应用。课题组前期从舟山海域石油污泥中筛选出1株分泌脂肪酶的菌株,经分子鉴定后确定为液化沙雷氏菌,将其命名为液化沙雷氏菌ZS6。ZS6菌株脂肪酶分泌量较低,因此... 脂肪酶(E.C.3.1.1.3)在日常生活及工业生产中涉及油脂处理的方面有着广泛应用。课题组前期从舟山海域石油污泥中筛选出1株分泌脂肪酶的菌株,经分子鉴定后确定为液化沙雷氏菌,将其命名为液化沙雷氏菌ZS6。ZS6菌株脂肪酶分泌量较低,因此采用大肠杆菌表达体系对ZS6脂肪酶进行重组表达。使用pET28a质粒作为重组蛋白表达载体,通过IPTG诱导大肠杆菌表达脂肪酶蛋白。表达产物经纯化—复性—冻干处理后得到脂肪酶结晶,经分光光度法测得活性达到1400 U·mg^(-1)。该研究结果可以应用于固定化脂肪酶的制备以及脂肪酶的工业化生产。 展开更多
关键词 沙雷氏菌 脂肪酶 重组表达
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中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析 被引量：15
10
作者 卜兴江 杜欣军 +2 位作者 周文杰 赵小凡 王金星 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期723-732,共10页
溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因),该基因全长709bp,其完整... 溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因),该基因全长709bp,其完整的阅读框为477bp,编码158个氨基酸,前18个氨基酸(-1^-18)为信号肽,成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa),其分子量为16.2kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达,但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达和亲和纯化,得到了纯化的重组溶菌酶,并进行了抑菌活性检测。结果表明,重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强,最小抑菌浓度达到3.43μmol/L,但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明,该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子,参与了对虾的免疫防御反应。 展开更多
关键词 中国明对虾 溶菌酶 先天免疫 重组表达
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乳铁蛋白的理化性质及其重组表达系统的研究进展 被引量：13
11
作者 庞晓楠 弘笑 +3 位作者 魏璇 陈喜文 刘佳 陈德富 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期873-884,共12页
乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)是分子量大小约为80 k Da的铁离子结合糖蛋白,是转铁蛋白(Transferrin,Tf)家族的成员之一。其理化性质独特,具有抑菌、抗病毒、抗癌、免疫调节、调节铁离子的吸收等诸多生物学功能。获得高产且有生物活性的重... 乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)是分子量大小约为80 k Da的铁离子结合糖蛋白,是转铁蛋白(Transferrin,Tf)家族的成员之一。其理化性质独特,具有抑菌、抗病毒、抗癌、免疫调节、调节铁离子的吸收等诸多生物学功能。获得高产且有生物活性的重组乳铁蛋白,并用于临床治疗,一直是研究热点。随着基因工程技术的发展,已获得多个可表达重组乳铁蛋白的表达系统。本文对乳铁蛋白的理化性质、生物学活性、临床研究以及目前的重组表达系统进行综述,以期为乳铁蛋白的临床应用提供参考。 展开更多
关键词 乳铁蛋白 抑菌 抗病毒 免疫调节 重组表达系统
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大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定 被引量：11
12
作者 宋柬 马会勤 +2 位作者 郝佳 任发政 陈尚武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第7期29-35,共7页
利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉... 利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。 展开更多
关键词 苯丙氨酸解氨酶(PAL) pET-31b(+) 基因克隆 重组表达 肉桂酸
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布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究 被引量：7
13
作者 李鹏 罗德炎 +3 位作者 高永辉 张松乐 宋艳 王希良 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期493-497,共5页
目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射... 目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 布氏杆菌BCSP31 重组表达质粒 免疫应答 免疫保护
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HIV蛋白质优势B细胞抗原表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定 被引量：6
14
作者 杜勇 徐静 +2 位作者 李敬云 侯利华 王海涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期270-276,共7页
设计了一种新的病原体蛋白质B细胞抗原表位的筛选和重组表达方法。不须使用抗原 ,而通过交替用病人血清IgG抗体“淘洗”(biopanning)随机肽库和用正常人血清IgG反向吸附 ,来获得特异抗原表位资料。用HIV病人血清的IgG抗体淘洗噬菌体递... 设计了一种新的病原体蛋白质B细胞抗原表位的筛选和重组表达方法。不须使用抗原 ,而通过交替用病人血清IgG抗体“淘洗”(biopanning)随机肽库和用正常人血清IgG反向吸附 ,来获得特异抗原表位资料。用HIV病人血清的IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机十二肽库 ,再以正常人IgG抗体吸附 ,筛选到了能和HIV病人血清发生特异反应的噬菌体克隆 ,经ELISA、DNA测序等 ,成功地筛选出了位于HIVgp41外膜蛋白、高亲和力、构型特异的优势B细胞抗原表位 ( 60 2 GCSGKLICTTNV61 3)。用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架 ,在其活性部位以“内融合”形式重组表达了该抗原表位 ,纯化的重组蛋白具有良好的抗原性 ,能与HIV( + )IgG抗体及艾滋病人血清呈特异反应 ,表明本技术路线可以有效地进行HIV蛋白质的B细胞抗原表位筛选和重组表达。此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究 ,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据。 展开更多
关键词 HIV 抗原表位 随机肽质 重组表达 ELISA
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结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体重组表达及鉴定 被引量：7
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作者 蒋天舒 周晔 +5 位作者 吴传勇 陈燕 陈波 谷明莉 仲人前 邓安梅 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期170-172,177,共4页
目的重组表达结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体,以进一步探讨其免疫效应。方法选取结核分枝杆菌抗原表位KLIANNTRV,引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR),并以RVKR序列作为接头,分别合成结核分枝杆菌保护性... 目的重组表达结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体,以进一步探讨其免疫效应。方法选取结核分枝杆菌抗原表位KLIANNTRV,引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR),并以RVKR序列作为接头,分别合成结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列,经PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果成功构建了结核分枝杆菌保护性表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为20000、32000、54000的融合蛋白。结论结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体的重组表达为进一步开发结核疫苗提供有价值的依据。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 表位 重组表达 纯化
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青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备(英文) 被引量：6
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作者 冯浩 成嘉 +4 位作者 刘妍 骆剑 李建中 刘少军 刘筠 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期729-734,共6页
以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素(GH)成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆... 以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素(GH)成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western blot可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。结果表明:得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。 展开更多
关键词 青鱼 生长激素 重组表达 多克隆抗体
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棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化 被引量：6
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作者 赵小凡 蒋晓娟 +2 位作者 徐筠娉 刘延荷 王金星 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期281-286,共6页
蜕皮调节转录因子 (hormonereceptor 3,HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达 ,并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达 ,对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用。利用合成的特异性引物通过RT_PCR扩增了棉铃虫Helicoverpaarmigera蜕... 蜕皮调节转录因子 (hormonereceptor 3,HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达 ,并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达 ,对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用。利用合成的特异性引物通过RT_PCR扩增了棉铃虫Helicoverpaarmigera蜕皮调节转录因子 (HHR3) ,并与pGEX_4T_1载体连接 ,在大肠杆菌EscherichiacoliDH5α内进行扩增 ,经过PCR筛选获得了HHR3_pGEX_4T_1重组质粒。用该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL2 1并进行诱导表达 ,获得了与谷胱甘肽_S转移酶 (GST)融合表达的HHR3包涵体 ,分子量在 94kD左右 ,通过无离子去垢剂CAPS(3_[cyclohexylamino]_1_propanesulfonicacid)变性、复性后获得了可溶性GST_HHR3融合蛋白 ,经凝血酶裂解和SDS_PAGE分离得到纯化的HHR3,经蛋白质N_端测序确认表达正确。用重组表达的HHR3免疫家兔 ,制备了兔抗HHR3多克隆抗体 ,免疫印迹检测显示该抗体对HHR3有特异性识别能力 ,可以用于HHR3功能与调控等下游研究。免疫印迹检测结果还表明 ,HHR3在 5龄向 6龄蜕皮的幼虫脂肪体中高表达 ,在进入 6龄 2 4h的幼虫脂肪体中含量明显下降 ,在 6龄 72h的幼虫中肠中没有检测到HHR3表达 ;成虫卵巢中有HHR3表达。 展开更多
关键词 棉铃虫 蜕皮调节转录因子 重组表达 包涵体纯化 抗体制备
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中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因全长cDNA克隆和重组表达 被引量：7
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作者 孙妍 张亦陈 +5 位作者 刘逸尘 王雪惠 王宇凡 耿绪云 孙金生 杨卫军 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期210-217,共8页
根据实验室分离自中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的一种蜕皮抑制激素(Molting-inhibiting hormone,MIH)N端氨基酸测序结果设计简并引物,采用RACE方法,首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆到蜕皮抑制激素基因全长cDNA(Es-MIH,GenBank登录号:DQ34... 根据实验室分离自中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的一种蜕皮抑制激素(Molting-inhibiting hormone,MIH)N端氨基酸测序结果设计简并引物,采用RACE方法,首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆到蜕皮抑制激素基因全长cDNA(Es-MIH,GenBank登录号:DQ341280),该基因全长为1457 bp,开放阅读框为330 bp,编码110个氨基酸(含有35个氨基酸的信号肽);其成熟肽包含C7-C44、C24-C40和C27-C53三个二硫键,有典型的CHH家族结构域。该cDNA编码的氨基酸序列与地蟹(Gecarcinus lateralis)MIH同源性最高,达到了85%。Northern杂交和半定量RT-PCR显示蜕皮间期成体蟹仅在眼柄中有MIH基因表达,提示该基因的表达具有一定组织特异性。利用pCR T7/NT TOPO TA系统重组表达MIH成熟肽,纯化的重组蛋白得率为0.3 g/L,纯化产物经质谱鉴定为中华绒螯蟹MIH。研究解决了CHH家族神经肽在机体中的表达量少,直接纯化较难的问题,为深入研究MIH的作用机制和在生产上控制中华绒螯蟹蜕皮和生长奠定了基础。 展开更多
关键词 中华绒螯蟹 蜕皮抑制激素基因 组织表达 重组表达 纯化
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中国明对虾C-型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析 被引量：7
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作者 刘逸尘 刘丽静 +3 位作者 张亦陈 耿绪云 孙妍 孙金生 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1493-1502,共10页
研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进... 研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。 展开更多
关键词 中国明对虾 C-型凝集素 糖识别结构域 先天免疫 重组表达 凝菌 抑菌活性
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中国明对虾组织蛋白酶L的原核重组表达及其组织分布 被引量：6
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作者 卜兴江 仉晓文 +2 位作者 孙允东 赵小凡 王金星 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期910-916,共7页
组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到... 组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复性,并进行His-tag柱亲和纯化,得到了纯化的蛋白。利用重组蛋白制备了的兔抗血清。Western实验表明,组织蛋白酶L在中国明对虾的肝、胃、肠中有表达,而在卵巢中没有表达。 展开更多
关键词 中国明对虾 组织蛋白酶L 原核重组表达 组织分布
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