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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
1
作者 刘丹 黄小洁 +5 位作者 吴华伟 孙淼 陈延飞 秦义娴 侯力丹 薛麒 《动物医学进展》 2024年第4期51-56,共6页
为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 间接elisa 抗体检测
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猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用
2
作者 裴艳艳 张梦琳 +6 位作者 许浒 相丽润 张洪亮 彭金美 王倩 田志军 周国辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2024年第1期55-60,69,共7页
猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-... 猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性。SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,r LI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的r LI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法。各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的r LI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度为1∶10000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min。利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况。结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在。本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI血清流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 胞内劳森氏菌 间接elisa 抗体检测 LI0841重组蛋白
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猪丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用
3
作者 秦秋英 张政 +6 位作者 黄夏玲 洪大林 隆美金 陈樱 韦祖樟 黄伟坚 欧阳康 《中国兽医科学》 CAS CSCD 2024年第1期48-55,共8页
为建立快速、高效检测猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)的血清学方法,构建了pET-32a-S-S1b重组质粒,通过原核表达获得重组S1b蛋白,以此为包被抗原建立了检测血清中PDCoV IgA抗体的间接ELISA方法,对该检测方法的反应条件... 为建立快速、高效检测猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)的血清学方法,构建了pET-32a-S-S1b重组质粒,通过原核表达获得重组S1b蛋白,以此为包被抗原建立了检测血清中PDCoV IgA抗体的间接ELISA方法,对该检测方法的反应条件进行优化,验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示:重组S1b蛋白呈包涵体表达,大小为34.7 ku,反应原性良好;建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:250 ng/孔抗原4℃过夜包被,10 g/L BSA 37℃封闭2 h,待检血清1∶200稀释37℃孵育45 min,二抗1∶10000稀释37℃孵育1 h,显色时间为10 min。测定24份阴性血清,确定临界值为0.388。检测阳性血清敏感度为1∶1600;批间和批内重复试验的变异系数均小于10%;本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪肠病毒标准血清无交叉反应。选取30份血清,与Western-blot检测结果比较,该间接ELISA的符合率为96.66%。应用该方法对486份临床血清样品进行检测,阳性率为32.72%。本研究中建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 S蛋白S1b 间接elisa 临床检测
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立
4
作者 任建乐 林铱婷 +9 位作者 姬康 谭姗姗 陈新新 晋怡 王颖 牛胜 梁立滨 李俊平 赵宇军 田文霞 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 2024年第2期678-688,共11页
[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,... [目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒(SVA) VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 间接elisa
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基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用
5
作者 刘广阔 吴发兴 +4 位作者 于皓同 王凯茸 张锐铮 张琪 许信刚 《动物医学进展》 2024年第3期28-33,共6页
为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为... 为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。 展开更多
关键词 羊伪狂犬病 伪狂犬病病毒 gE蛋白 间接elisa
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猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立
6
作者 杨敩校 刘芊麟 +5 位作者 陈丙生 蒋小玲 王建舫 董虹 肖兴 周双海 《北京农学院学报》 2024年第1期43-46,共4页
【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床... 【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。 展开更多
关键词 猪细环病毒1型 衣壳蛋白 间接elisa 抗体 检测
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基于N和G蛋白的HeV抗体间接ELISA检测方法的建立
7
作者 朱盈名 王迎平 +5 位作者 冯旭东 朱桓奕 杨晓伟 陈翔 王艳 赵光伟 《动物医学进展》 2024年第3期9-15,共7页
为了建立亨德拉病毒(HeV)抗体的间接ELISA检测方法,人工合成HeV的N和G基因,并将其分别连接到原核表达载体PET-30a,经IPTG诱导、变复性处理及纯化后获得表达蛋白,免疫健康马获得阳性血清,用矩阵法对蛋白包被浓度和一抗稀释倍数进行确定,... 为了建立亨德拉病毒(HeV)抗体的间接ELISA检测方法,人工合成HeV的N和G基因,并将其分别连接到原核表达载体PET-30a,经IPTG诱导、变复性处理及纯化后获得表达蛋白,免疫健康马获得阳性血清,用矩阵法对蛋白包被浓度和一抗稀释倍数进行确定,优化包被时间、封闭剂以及孵育时间等技术参数,并对建立方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性进行评估。经SDS-PAGE和Western blot验证,N和G两个蛋白均实现高效表达,间接ELISA方法中二者的最佳包被浓度分别为10μg/mL和8μg/mL,一抗血清的稀释倍数为1∶800,优化后的最佳反应条件为:N蛋白4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,一抗孵育时间30 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用60 min;G蛋白4℃包被过夜,2%BSA 37℃封闭2 h,一抗孵育时间80 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用80 min。结果表明,所建方法N蛋白的灵敏性大于1∶12800,G蛋白大于1∶6400,二者的临界值分别为0.235和0.267,特异性良好,批内、批间变异系数均小于10%,重复性良好,二者ROC曲线下面积分别为0.91和0.93,准确性高。试验结果可为海关、口岸以及出入境检验检疫等部门HeV临床血清学诊断提供技术支撑。 展开更多
关键词 亨德拉病毒 N蛋白 G蛋白 间接elisa
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绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
8
作者 李祥龙 章志涛 +3 位作者 孔令丽 罗雨昕 秦泽亮 王冬英 《动物医学进展》 2024年第4期16-20,共5页
为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号:CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间... 为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号:CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。 展开更多
关键词 绵羊支原体 热休克蛋白70 原核表达 间接elisa
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边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
9
作者 罗雨昕 赵敏 +3 位作者 陈琬婷 邹予 咸承俊 王冬英 《现代畜牧科技》 2024年第3期17-20,共4页
为建立可检测边缘无形体(Anaplasma marginale)的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列(登录号:EU526889),构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA... 为建立可检测边缘无形体(Anaplasma marginale)的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列(登录号:EU526889),构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。 展开更多
关键词 边缘无形体 MSP2蛋白 原核表达 间接elisa
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非洲猪瘟病毒无标签p35蛋白的制备及间接ELISA抗体检测方法的建立
10
作者 吴植 卢会鹏 +4 位作者 王安平 谢军 曹世诺 徐艳 朱善元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第5期1209-1216,共8页
为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签... 为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10000,阴性和阳性判定阈值OD450为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的ASFV无标签p35蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于ASFV抗体的检测,为该病的进一步精准检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 类弹性蛋白 无标签p35蛋白 间接elisa方法
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牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立
11
作者 张妍 战力源 +2 位作者 姜福洁 马红霞 孔令聪 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4621-4631,共11页
【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋... 【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达,使用镍柱进行蛋白纯化,经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小,采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性;将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化,确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证,P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上;Western blotting检测结果显示,P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带,该蛋白特异性和反应原性良好;琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为:抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1280稀释,37℃孵育60 min,二抗稀释度为1∶5000,37℃孵育60 min,邻苯二胺常温显色10 min。结果判定标准为:D 492 nm值>0.3196为阳性;D 492 nm值<0.3101为阴性;0.3101≤D 492 nm值≤0.3196为可疑。敏感性试验结果显示,当阳性样品稀释度为1∶218时,阳性血清判读结果仍为阳性。稳定性试验结果显示,3批次P48蛋白包被的96孔板检测结果的变异系数均<10%;与牛溶血性曼氏海姆杆菌、牛巴氏杆菌阳性血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA抗体检测方法与平板凝集试验阳性血清符合率为100%(18/18),阴性血清符合率为97.5%(39/40)。【结论】本研究建立的牛支原体P48间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,为牛支原体抗体检测及牛支原体疫苗效力检测提供了方法。 展开更多
关键词 牛支原体 P48蛋白 间接elisa
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立
12
作者 江锦秀 林裕胜 +4 位作者 张靖鹏 游伟 张龙 毛坤明 胡奇林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期45-50,共6页
为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb... 为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 单克隆抗体 间接elisa
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副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用 被引量：4
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作者 张鹏云 陈敏 +3 位作者 刘明星 周红 蔺辉星 范红结 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1606-1614,共9页
【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、... 【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型,是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒,为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白,使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,优化间接ELISA反应条件,并组装试剂盒。在此基础上,确定该试剂盒的敏感性、特异性;通过对不同时间、不同猪场采集的2000份临床猪血清样本进行检测,评价该试剂盒的实用性;在以上临床血清样本中随机选取200份,分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测,比较检测结果,验证该试剂盒的符合率;最后,使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清,评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白,发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化,确定OppA包被浓度为1μg·mL-1,封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液,样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液,样品孵育时间为30min,样品稀释度为1﹕50,酶标二抗孵育时间为30min,底物作用时间为15 min,临界值为0.18;试剂盒的敏感性和特异性为96.67%,能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应;2000份临床血清样本阳性检出率为34.65%;随机抽取200份血清样本,与间接血凝试验的符合率为92.50%,与进口商品化试剂盒符合率为87.00%,符合率较高;使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清,HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强,与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高,可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 ABC转运体周质底物结合蛋白 间接elisa 免疫评价
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猪源盖塔病毒抗体间接ELISA检测方法的初步建立及其优化 被引量：2
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作者 朱世强 王帅勇 +9 位作者 王娟 虞凌雪 姚云 张毅峰 周艳君 单同领 郑浩 童武 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期66-71,共6页
为了建立猪源盖塔病毒(GETV)血清学ELISA抗体检测方法,本实验首先在PK-15细胞上增殖猪源盖塔病毒(GETV-SD1),并对病毒进行灭活处理和超离纯化,将纯化的灭活GETV作为包被抗原,经过包被条件的优化,初步建立了GETV特异性抗体检测的间接ELIS... 为了建立猪源盖塔病毒(GETV)血清学ELISA抗体检测方法,本实验首先在PK-15细胞上增殖猪源盖塔病毒(GETV-SD1),并对病毒进行灭活处理和超离纯化,将纯化的灭活GETV作为包被抗原,经过包被条件的优化,初步建立了GETV特异性抗体检测的间接ELISA方法。结果显示:GETV粒子的最佳包被浓度为200 ng/孔,最佳包被条件为4℃孵育过夜,最佳封闭条件4℃封闭2 h,血清最佳孵育条件为37℃孵育2 h,血清最佳稀释比1∶200,临界值为0.181;特异性检测试验结果表明,该检测方法具有GETV特异性;所建立的方法也具有较好的重复性,批内、批间重复率变异系数均小于10%;通过稀释阳性血清表明该方法具有较好的敏感性。本研究建立的猪源盖塔病毒抗体的间接ELISA检测方法为GETV抗体的有效监测奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 猪源盖塔病毒 全病毒蛋白 间接elisa
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猪流行性腹泻病毒S1蛋白IgG抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
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作者 钱嘉莉 宋旭 +6 位作者 张雪 王传红 徐红 王丹丹 王先炜 范宝超 李彬 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期269-276,共8页
根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的S1基因序列,与pcDNA3.1载体构建重组表达质粒pcDNA-12S1,利用瞬时转染方法将pcDNA-12S1转染至293F细胞,每隔24 h取样,进行Western-blot检测,确定最佳收样时间,并采用镍离子亲和层析技术进行蛋白纯化... 根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的S1基因序列,与pcDNA3.1载体构建重组表达质粒pcDNA-12S1,利用瞬时转染方法将pcDNA-12S1转染至293F细胞,每隔24 h取样,进行Western-blot检测,确定最佳收样时间,并采用镍离子亲和层析技术进行蛋白纯化。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,该S1蛋白的纯度高、免疫原性好。以S1蛋白作为包被抗原,建立并优化了IgG抗体间接ELISA方法。结果显示,S1蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/m L;最佳封闭剂和最佳封闭时间为5%脱脂奶粉溶液37℃作用3 h;待检血清和酶标二抗的最佳稀释度分别为1∶100和1∶20000,最佳孵育时间均为37℃30 min。采用该方法检测猪非典型瘟病毒(APPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪轮状病毒(PoRV)的阳性血清,结果均为阴性,表明该方法特异性好;该方法的批内和批间变异系数(CV)均<9%,表明该方法重复性较好;该方法与间接免疫荧光(IFA)相比较,阳性符合率为93.54%,阴性符合率为94.74%,总符合率为94%。上述结果表明,该方法可用于检测临床猪血清中的PEDV抗体,为PEDV的感染与接种疫苗后的免疫保护状态监测提供有效依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S1蛋白 293F细胞 间接elisa
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产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA方法的建立 被引量：1
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作者 王武斌 崔洁文 +4 位作者 曹小安 高鹏程 马清龙 李学瑞 储岳峰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期426-433,共8页
为建立绵羊产气荚膜梭菌ε毒素抗体间接ELISA检测方法,对D型产气荚膜梭菌(C60-1株)的ε毒素基因进行扩增,构建pET-32a-ε重组质粒,转入BL21(DE3)PlysS诱导蛋白表达,经Ni柱纯化后获得可溶性ε毒素重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原... 为建立绵羊产气荚膜梭菌ε毒素抗体间接ELISA检测方法,对D型产气荚膜梭菌(C60-1株)的ε毒素基因进行扩增,构建pET-32a-ε重组质粒,转入BL21(DE3)PlysS诱导蛋白表达,经Ni柱纯化后获得可溶性ε毒素重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和临床检测中的应用进行验证。结果显示,重组蛋白包被浓度为0.5μg/m L,封闭液为1%BSA,待检绵羊血清1∶100稀释,家兔抗山羊HRP酶标二抗1∶5000稀释,显色液避光显色20 min为最佳反应条件。测定45份阴性血清,计算其平均值(X)和标准差(SD),确定所建立的ε毒素抗体间接ELISA方法的阴阳性临界值(X+3SD)为0.254。检测阳性血清敏感度为1∶3200,批间和批内重复率显示,变异系数均小于10%,特异性试验显示,检测羊痘病毒(SPV)、蓝舌病病毒(BTV)、羊布鲁氏菌、沙门菌和绵羊肺炎支原体均没有特异性反应。检测90份临床羊血清样品,该间接ELISA方法与商品化试剂盒之间的阳性符合率为82.9%,阴性符合率为95%,总符合率为85.6%。结果表明,本试验建立的方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步用于绵羊产气荚膜梭菌ε毒素抗体的检测。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 ε毒素 原核表达 间接elisa
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检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA方法和HI试验方法的建立及初步应用 被引量：2
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作者 陈杨 孟林春 +6 位作者 郭梦娇 张成成 薄宗义 楚电峰 曹永忠 吴艳涛 张小荣 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期2062-2072,共11页
本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血... 本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709,R^(2)=0.9176,S/P临界值为0.32,临界滴度是1200。经验证,rVlhA-ELISA方法具有良好的特异性、重复性,最低能检出1∶2000稀释的阳性血清。选择国内MG分离株SH/2020-1作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验进行血清样品检测,IDEXX-MG方法作为对照,借助RT-qPCR方法监测MG感染情况。结果表明rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG监测的血清抗体趋势与HI复核结果均一致;rVlhA-ELISA与HI联合判定结果与IDEXX-MG符合率可达91.53%。上述结果显示,本研究建立的rVlhA-ELISA方法和HI试验具有较好的临床应用价值,可以初步应用于MG感染的临床大规模、快速筛查并对结果进行复核。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 VlhA蛋白 抗体检测 间接elisa
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布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法的建立及免疫原性评估 被引量：1
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作者 邓肖玉 徐锦凤 +4 位作者 何金科 谢珊珊 王勇 王震 陈创夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期107-114,共8页
目的建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种... 目的建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种亚单位疫苗,免疫小鼠后检测抗体水平、脾脏淋巴细胞的增殖水平、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞比值以及细胞因子分泌,最后通过攻毒试验评估OMP10的免疫保护效果。结果OMP10作为诊断抗原的特异性和符合率均高于70%;免疫小鼠后2种亚单位疫苗均能产生高滴度的IgG抗体,CD4^(+)/CD8^(+)T的比值均高于PBS对照组,IFN-γ高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),但IL-4未发生明显变化,表明OMP10能够诱导很好的体液免疫及Th1型免疫应答。免疫保护结果显示,2种亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏指数和脾脏载菌量低于布鲁氏菌M5感染组,差异具有统计学意义(P<0.01),表明OMP10蛋白配伍的亚单位疫苗对布鲁氏菌M5感染小鼠具有高度的保护作用。结论外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌诊断和疫苗方面具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白OMP10 间接elisa 抗体水平 细胞因子 免疫保护
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猪嵴病毒VP0基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
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作者 韩磊 彭志豪 +5 位作者 刘莹 顾文源 王丙雷 郭禹 左玉柱 范京惠 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期72-77,共6页
本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法... 本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法最适反应条件是抗原包被浓度为0.62μg/mL,血清稀释浓度为1∶200,最佳酶标二抗稀释浓度1∶5000,使用5%脱脂奶粉作为封闭液37℃孵育1 h,显色10 min,当检测样品OD_(450)<0.225判定血清样品抗体为阴性,OD_(450)≥0.225判定血清样品抗体为阳性,且特异性高、重复性好,与Western blot符合率达到95.6%。PKV VP0蛋白间接ELISA方法的建立,作为一种操作简单,灵敏度高,特异性高,重复性好的血清学检测方法,为PKV的监测和预防提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪嵴病毒 VP0基因 原核表达 间接elisa检测
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基于截短绵羊鹦鹉热衣原体r MOMP_(183-390)蛋白的间接ELISA检测方法建立与应用 被引量：1
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作者 曲磊 朱日宁 +6 位作者 鞠安琪 魏天 肖丹 王成宇 王思月 张芳毓 王永志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期710-715,共6页
为建立绵羊鹦鹉热衣原体(Cp)间接ELISA抗体检测方法,本实验将编码Cp主要外膜蛋白MOMP的omp A基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后,合成质粒p ET-28b(+)-omp A,另外设计特异性引物,分别将omp A截短克隆至p ET-28b(+)载体中构建重组表... 为建立绵羊鹦鹉热衣原体(Cp)间接ELISA抗体检测方法,本实验将编码Cp主要外膜蛋白MOMP的omp A基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后,合成质粒p ET-28b(+)-omp A,另外设计特异性引物,分别将omp A截短克隆至p ET-28b(+)载体中构建重组表达质粒p ET-28b(+)-omp A_(1-182)和p ET-28b(+)-omp A_(183-390),测序鉴定正确后分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导并纯化后,经western blot鉴定3个重组蛋白,结果显示,重组MOMP_(183-390)蛋白(r MOMP_(183-390))表达效果最好。以r MOMP_(183-390)作为包被抗原,采用方阵滴定法优化各反应条件,初步建立了检测Cp抗体的间接ELISA方法。采用建立的该方法检测羊痘病毒、布鲁氏菌、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒等羊临床常见病的阳性羊血清,结果显示,除Cp外,该方法与其他阳性羊血清均无交叉反应,特异性强;将Cp阳性血清2倍倍比稀释(1∶50~1∶6400)后采用该方法检测,结果显示,当Cp阳性血清稀释达1∶1600时,仍可检测到抗体,敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均小于10%。采用本研究建立的ELISA方法,以及间接血凝(IHA)试验和western blot分别检测随机选取的120份临床羊血清,结果显示该方法与IHA、western blot的总符合率分别为85%和91.67%;进一步采用建立的间接ELISA方法检测381份吉林省5家羊场的绵羊血清样品,结果显示阳性率为22.83%(87/381)。本研究建立的绵羊Cp omp A重组截短蛋白的间接ELISA抗体检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为Cp临床样品检测及流行病学调查提供了可靠的技术手段。 展开更多
关键词 鹦鹉热衣原体 omp A基因 间接elisa 待检血清 抗体检测
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