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E1A激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移 被引量:11
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作者 韩雅玲 胡叶 +3 位作者 刘海伟 康建 闫承慧 李少华 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第6期517-522,共6页
为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,G... 为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的空载体pLNCX(+)/GFP和正常HITASY为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染HITASY.经G418筛选,获得稳定感染的细胞克隆.应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测CREG和平滑肌分化标志蛋白α-肌动蛋白(SMα-actin)表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)的活性.结果表明:pLNCX2(+)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达上调,MMP-2和MMP-9活性升高,细胞迁移速度加快;pLXSN(-)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达下调,MMP-2和MMP-9活性降低,细胞迁移速度减慢.上述研究提示CREG在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移. 展开更多
关键词 阻遏子 腺病毒蛋白E1A 分化 迁移 逆转录病毒载体 平滑肌
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人E1A激活基因阻遏子的表达、抗体制备及生物学活性分析 被引量:5
2
作者 韩雅玲 刘海伟 +3 位作者 闫承慧 康建 王效增 胡叶 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期570-574,共5页
目的:构建人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体。探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位。方法:用PCR技术... 目的:构建人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体。探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位。方法:用PCR技术,扩增hCREG并构建pGEX-4T-1/hCREG原核表达载体。诱导表达重组谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)-hCREG融合蛋白。以GST-hCREG为抗原,制备兔抗人GST-hCREG的抗血清,并通过蛋白A和GST亲和层析纯化。用ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性;用免疫荧光染色法检查去血清培养前后HITASY细胞中hCREG蛋白的表达及定位;用BrdU染色观察分泌型hCREG蛋白对HITASY细胞增殖的影响。结果:经鉴定证实构建的重组质粒正确。诱导后pGEX-4T-1/hCREG菌株可表达大量的GST-hCREG融合蛋白,层析纯化后其纯度达90%。Westernblot检测表明,纯化的兔抗hCREG抗体可与hCREG蛋白特异性结合。ELISA测得该抗体的效价>1∶105。免疫荧光染色检测显示,去血清培养诱导的HITA-SY细胞中hCREG蛋白的表达增加且定位在核周围。BrdU染色表明,hCREG可明显抑制HITASY细胞增殖。结论:成功地获得兔抗hCREG抗体。证实去血清培养的血管平滑肌细胞中CREG蛋白的表达上调。表达的hCREG蛋白可抑制HI-TASY细胞增殖,提示hCREG可能参与调控血管平滑肌细胞的增殖与分化。 展开更多
关键词 腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子 纯化 抗体 增殖 血管平滑肌细胞
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E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡 被引量:5
3
作者 吴光哲 闫承慧 +7 位作者 韩雅玲 陶杰 邓捷 田孝祥 张保海 王涛 康建 张效林 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1597-1606,共10页
血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程.E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用.前期研究发现CREG... 血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程.E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用.前期研究发现CREG蛋白过表达能够对抗血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)凋亡,进一步探讨CREG对hVSMCs凋亡的调控作用及相关的分子机制.以逆转录病毒稳定转染的CREG过表达及表达抑制的hVSMCs为模型,应用两种药物Staurosporine(STS)和Etoposide(VP-16)诱导细胞发生凋亡,检测细胞凋亡和相关信号通路变化.结果显示,在药物干预后,CREG表达抑制时细胞凋亡明显增多,而CREG过表达明显抑制hVSMCs凋亡.同时也发现,CREG表达抑制时p38及JNK活性明显增强,而CREG过表达时p38和JNK活性被抑制.经腺病毒转染和药物干预抑制p38表达后,细胞凋亡均受到抑制,而且在p38活性被抑制的同时,JNK活化也受到抑制.说明p38和JNK表现为协同作用.结果也显示,VSMCs分化指标SMα-actin和SM MHC与CREG表达呈一致趋势,而细胞外基质蛋白Fibronection与CREG表达呈负相关.以上结果提示,CREG在维持VSMCs表型转换方面发挥重要作用,并且通过p38和JNK信号转导通路对hVSMCs凋亡进行调控.CREG可能对于AS和PCI术后RS的防治具有重要价值. 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 血管平滑肌细胞 细胞凋亡 信号通路
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E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加 被引量:3
4
作者 王占胜 韩雅玲 +4 位作者 康建 张效林 陶杰 田孝祥 闫承慧 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期37-41,共5页
目的:探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)诱导的人血管内皮细胞(ECs)单层通透性改变中的作用及机制。方法:用CREG过表达及CREG表达下调的ECs为模型,Transwell chamber弥散模型观察ECs单层通透性的改变;荧光倒置显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-ac... 目的:探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)诱导的人血管内皮细胞(ECs)单层通透性改变中的作用及机制。方法:用CREG过表达及CREG表达下调的ECs为模型,Transwell chamber弥散模型观察ECs单层通透性的改变;荧光倒置显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin及黏附连接蛋白VE-cadherin在ECs中的分布和形态学改变;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs血管内皮生长因子(VEGF)分泌。结果:CREG过表达的ECs(EO组)较EN组单层通透性明显增高(P<0.05);CREG表达下调的ECs(ES组)较EN组单层通透性有所下降(P<0.05)。与EN组相比较,EO组细胞中F-actin排列紊乱,形成大量应力纤维;ES组F-actin则主要呈细丝状分布于细胞周边,中央分布较少。同时,EO组VE-cadherin在细胞周边的正常拉链状结构减少或缺失,细胞间隙增宽;而ES组VE-cadherin在细胞周边呈正常拉链状分布,细胞之间连接紧密。ELISA检测显示EO组细胞上清中VEGF分泌较EN组明显增加(P<0.05);ES组VEGF分泌较EN组减少(P<0.05)。应用VEGF中和抗体阻断后,CREG过表达引起的EO通透性增加的现象明显受到抑制。结论:CREG过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起F-actin重构及VE-cadherin减少,使血管内皮细胞单层通透性增加。 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 血管内皮细胞 VE-CADHERIN 细胞骨架 通透性 血管内皮生长因
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类固醇受体辅助活化因子-1和核受体辅阻遏子在子宫腺肌病中的表达 被引量:3
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作者 李燕 王琴 +3 位作者 唐利 陈枫 史小玲 李宗恒 《实用妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期402-405,共4页
目的:通过检测子宫腺肌病组织芯片中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)和核受体辅阻遏子(NCoR)的表达,观察SRC-1、NCoR与ER、PR之间的关系,探讨其在子宫腺肌病发生、发展中的作用。方法:用组织芯片技术... 目的:通过检测子宫腺肌病组织芯片中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)和核受体辅阻遏子(NCoR)的表达,观察SRC-1、NCoR与ER、PR之间的关系,探讨其在子宫腺肌病发生、发展中的作用。方法:用组织芯片技术和免疫组化方法检测42例子宫腺肌病患者异位子宫内膜组织(异位内膜组)和15例因子宫肌瘤行子宫切除术患者非瘤区对照子宫内膜组织(对照内膜组)中ER、PR、SRC-1和NCoR的阳性细胞的平均光密度值(IOD),及两组子宫内膜组织的增殖期和分泌期的IOD值,并进行比较。结果:ER、PR在异位内膜组中的IOD值显著低于对照内膜组(P<0.05);SRC-1在异位内膜组中IOD值明显高于对照内膜组(P<0.05);NCoR在异位内膜组中IOD值明显低于对照内膜组(P<0.05);异位内膜组中SRC-1、NCoR、ER和PR的IOD值增殖期和分泌期的比较,差异无统计学意义(P>0.05);对照内膜组中SRC-1、NCoR、ER和PR的IOD值增殖期高于分泌期(P<0.05)。结论:低表达的ER存在时,SRC-1在异位内膜组织中表达增高,低表达的PR可能降低NCoR的表达,SRC和NCoR可能导致子宫腺肌病异位内膜组织增生活性增高,可能与子宫腺肌病的种植和侵袭有关。 展开更多
关键词 类固醇受体辅助活化因-1 核受体辅阻遏子 宫腺肌病
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E1A激活基因细胞阻遏子蛋白在人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用 被引量:2
6
作者 陶杰 闫承慧 +3 位作者 郭鹏 吴光哲 王占胜 韩雅玲 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第37期7281-7285,共5页
背景:研究内皮细胞凋亡的机制及其与动脉硬化形成的关系将为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。而E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在内皮细胞凋亡中的作用,目前尚未见报道。目的:探讨E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在去血清诱导的人脐静脉内... 背景:研究内皮细胞凋亡的机制及其与动脉硬化形成的关系将为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。而E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在内皮细胞凋亡中的作用,目前尚未见报道。目的:探讨E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及其调控机制。时间及地点:实验于2007-10/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料:人脐静脉内皮细胞,Phoenixamphotropic293细胞,pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体。方法:采用持续去血清培养的方法诱导内皮细胞凋亡,用TUNEL染色和Westernblot检测去血清饥饿24,48,72h后各实验组细胞中cleave-caspase3表达;用pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,并筛选稳定表达的细胞克隆;应用Westernblot检测E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白的表达,并进一步应用流式双荧光染色分析E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白过表达在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。主要观察指标:cleave-caspase3表达量,人脐静脉内皮细胞凋亡率。结果:成功构建了E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞模型,证实内皮细胞E1A激活基因细胞阻遏子的表达随凋亡的增加而增加,E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞去血清饥饿后凋亡较对照组明显减少。结论:E1A激活基因细胞阻遏子过表达抑制了去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,机制可能与调控PI3K蛋白表达有关。 展开更多
关键词 E1A激活基因细胞阻遏子 凋亡 人脐静脉内皮细胞 PI3K
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E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子α引起的血管内皮细胞炎性损伤 被引量:2
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作者 段岩 李杰 +6 位作者 陶杰 游洋 栾波 刘少伟 张效林 闫承慧 韩雅玲 《中国动脉硬化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期721-726,共6页
目的探讨E1A激活基因阻遏子表达对血管内皮细胞病理性炎症反应的生物学作用及机制。方法以E1A激活基因阻遏子过表达和基因沉默的人动脉血管内皮细胞为细胞模型,应用肿瘤坏死因子α刺激,ELISA检测白细胞介素6的变化,Rhodamin-Phalloidin... 目的探讨E1A激活基因阻遏子表达对血管内皮细胞病理性炎症反应的生物学作用及机制。方法以E1A激活基因阻遏子过表达和基因沉默的人动脉血管内皮细胞为细胞模型,应用肿瘤坏死因子α刺激,ELISA检测白细胞介素6的变化,Rhodamin-Phalloidin检测肌动蛋白骨架F-actin分布,应用Transwell小室和Biotin标记的BSA检测单层内皮细胞通透性改变。进一步通过免疫荧光染色和Western blot检测细胞内核因子κB蛋白表达和转位情况。结果 ELISA检测发现,E1A激活基因阻遏子基因过表达显著抑制肿瘤坏死因子α刺激引起血管内皮细胞白细胞介素6的表达及分泌增加。同时,细胞F-actin应力纤维的形成和细胞单层通透性增加受到明显抑制。相反,E1A激活基因阻遏子基因沉默组白细胞介素6分泌较对照组明显增多。细胞F-actin应力纤维形成、细胞单层通透性显著增加。免疫荧光和Western blot分析证实,肿瘤坏死因子α刺激后,E1A激活基因阻遏子过表达组核因子κB出现短时的入核现象并迅速出核,对应蛋白出现相应的表达变化,而E1A激活基因阻遏子基因沉默组核因子κB表达持续增高且发生明显的入核转位现象。结论 E1A激活基因阻遏子可通过减少核因子κB的表达对抗肿瘤坏死因子α刺激引起的血管内皮细胞炎症反应和细胞通透性增加,对抗细胞病理性损伤发生。 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 血管内皮细胞 炎性损伤 核因KB
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核受体及其转录活化机制研究的新突破——辅活化子和辅阻遏子 被引量:4
8
作者 穆小民 刘以训 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1998年第3期222-226,共5页
核受体是一类配体依赖的转录因子,它们之间有相似的结构,在进化上来源于同一前体,它们和基础转录因子有直接的联系,与配体结合后,作用于其目标基因的特定应答元件上,从而活化特定基因的转录.核受体介导的转录活化需要有辅活化子... 核受体是一类配体依赖的转录因子,它们之间有相似的结构,在进化上来源于同一前体,它们和基础转录因子有直接的联系,与配体结合后,作用于其目标基因的特定应答元件上,从而活化特定基因的转录.核受体介导的转录活化需要有辅活化子(coactivator)和辅阻遏子(corepresor)的参与,这些辅活化子和辅阻遏子是有效的转录所必需的.它们能和核受体特异结合,并在核受体和基础转录因子之间发挥中介作用.目前发现普遍存在并在转录过程中具有重要作用的辅活化子有CBP/P300和SRC1等,辅阻遏子有SMRT等. 展开更多
关键词 核受体 转录因 辅活化 阻遏子
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E1A激活基因阻遏子基因表达变化与颈动脉血管重塑的关系 被引量:1
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作者 李洋 闫承慧 +2 位作者 田孝祥 彭程飞 韩雅玲 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2015年第2期161-168,共8页
E1A激活基因阻遏子(CREG)是一种广泛表达的小分子糖蛋白,但其生物学功能仍不完全清楚.为了探索病理性血管重塑的病理生理机制以及CREG在其中发挥的调控作用,采用颈动脉导丝损伤模型构建小鼠病理性血管重塑模型,应用小动物超声、Masson... E1A激活基因阻遏子(CREG)是一种广泛表达的小分子糖蛋白,但其生物学功能仍不完全清楚.为了探索病理性血管重塑的病理生理机制以及CREG在其中发挥的调控作用,采用颈动脉导丝损伤模型构建小鼠病理性血管重塑模型,应用小动物超声、Masson染色、免疫组织化学染色、RT-PCR、Western-blot等方法检测小鼠颈动脉内膜-中膜厚度、胶原含量、Ⅰ型胶原和CREG表达变化.结果表明,小鼠颈动脉损伤后3 d血管壁CREG m RNA和蛋白质水平迅速下降,损伤后7 d CREG表达回升,至损伤后14 d和28 d基本恢复到正常对照组水平.血管损伤后3 d血管壁中Ⅰ型胶原m RNA水平开始升高,损伤后7 d血管壁开始增厚,管壁中Ⅰ型胶原表达水平继续增高,损伤后14 d和28 d新生内膜形成,管腔严重狭窄,Ⅰ型胶原在管壁和新生内膜内大量表达.血管损伤早期CREG表达水平的变化与病理性血管重塑程度呈负相关关系,CREG的表达为先迅速降低,再逐渐回升,而胶原表达和血管重塑程度则表现为持续加重.上述研究结果提示,CREG基因表达参与血管损伤导致的病理性血管重塑过程,并可能决定了血管重塑的进程和结局. 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 血管重塑 小鼠
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E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移 被引量:1
10
作者 闫承慧 栾波 +2 位作者 李杰 张效林 韩雅玲 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2011年第37期6942-6946,共5页
背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因。目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制... 背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因。目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制。方法:应用已建立的稳定转染CREG过表达细胞hVSMCs-CREG和CREG表达沉默的hVSMCs-siCREG细胞株通过刮伤实验和Transwell小室细胞移行实验检测细胞迁移能力,通过Western blot检测转染前后细胞中CREG蛋白、基质金属蛋白酶和JNK表达及活化情况,应用JNK和基质金属蛋白酶9抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞迁移中的作用。结果与结论:Western blot结果证实,CREG蛋白表达在hVSMCs-CREG组中增加(P<0.05),而在hVSMCs-siCREG组中减少(P<0.05)。刮伤实验和Transwell实验分析结果证实hVSMCs-CREG组细胞较正常对照组细胞迁移能力受抑。相反,hVSMCs-siCREG组细胞迁移能力显著增加(P<0.05)。Western blot和明胶酶谱分析证实hVSMCs-siCREG组细胞中MMP9活性明显增加(P<0.05),同时JNK蛋白活化。进一步应用JNK抑制剂阻断研究证实,CREG蛋白表达抑制引起的血管平滑肌细胞迁移能力增加与细胞中基质金属蛋白酶9活性均受到剂量依赖性抑制。结果证实,CREG蛋白表达可抑制JNK-基质金属蛋白酶9信号通路的活化,以此抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移。 展开更多
关键词 蛋白 腺病毒E1A蛋白 E1A激活基因阻遏子 血管平滑肌细胞 迁移 组织构建
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E1A激活基因阻遏子在动脉粥样硬化血管中的表达及其与炎症因子的关系 被引量:3
11
作者 杨桂棠 韩雅玲 闫承慧 《心脏杂志》 CAS 2016年第1期7-10,24,共5页
目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)在动脉粥样硬化(AS)血管中的表达及其与炎症因子的关系。方法 Apo E(-/-)小鼠6周龄断奶后给予高脂喂养。8周后取主动脉血管,采用HE染色观察血管的形态学变化;采用免疫荧光染色观察CREG、SMα-actin和巨... 目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)在动脉粥样硬化(AS)血管中的表达及其与炎症因子的关系。方法 Apo E(-/-)小鼠6周龄断奶后给予高脂喂养。8周后取主动脉血管,采用HE染色观察血管的形态学变化;采用免疫荧光染色观察CREG、SMα-actin和巨噬细胞标志物Mac-3的表达变化。取高脂喂养的1~8周小鼠血管,采用Western blot方法检测AS血管中CREG及核转录因子(NF)-κB的表达的变化。结果在Apo E(-/-)小鼠高脂喂养8周,主动脉血管AS斑块明显形成,斑块内有胆固醇结晶,斑块凸凹不平,管腔明显狭窄。免疫荧光显示AS血管中,CREG表达明显下降,同时SMα-actin表达也下降,而Mac-3表达增高。Apo E(-/-)小鼠高脂喂养2~8周,取动脉血管行蛋白定量分析,结果显示高脂喂养2周时,CREG在动脉血管中的表达不是降低,而是明显升高,高脂喂养第4周,CREG表达急剧下降,而后又逐渐上升,但不能升至正常水平。同时NF-κB随着时间的推移,表达逐渐升高。结论在AS进程中,血管中膜的VSMCs由收缩表型向合成表型转化,细胞增生活跃、分化减弱,CREG作为维持VSMCs分化的蛋白,在血管中的表达与AS进展密切相关,同时伴随着炎症因子表达逐渐升高。 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 动脉粥样硬化 血管平滑肌细胞 ApoE(-/-)小鼠
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E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达 被引量:1
12
作者 刘海伟 韩雅玲 +2 位作者 康建 阎承慧 王效增 《沈阳部队医药》 2005年第3期147-151,共5页
为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制,采用PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体;以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型,[... 为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制,采用PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体;以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型,[3H]标记脱氧胸苷掺入法测定去血清培养HITASY 细胞DNA合成变化;Western blot观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM α-actin、calponin的表达,RT—PCR 和Western blot分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化;免疫组化观察CREG在细胞内的表达及定位。结果成功地构建了载体并得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长,除SM α-actin和calponin表达逐渐上调之外,CREC mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后,CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论:去血清能促使 HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换,同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。 展开更多
关键词 阻遏子 血管平滑肌细胞 表达 腺病毒E1A蛋白 多克隆抗体
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E1A激活基因阻遏子蛋白对抗人脐静脉血管内皮细胞的凋亡
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作者 闫承慧 王娜 +3 位作者 陶杰 李毅 王效增 韩雅玲 《中国组织工程研究》 CAS CSCD 2012年第46期8693-8697,共5页
背景:前期研究显示,E1A激活基因阻遏子能够通过抑制动脉平滑肌细胞的凋亡对抗动脉粥样硬化。目的:进一步阐明E1A激活基因阻遏子在内皮细胞凋亡中的作用。方法:通过去血清方法诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,然后进行TUNEL和caspas... 背景:前期研究显示,E1A激活基因阻遏子能够通过抑制动脉平滑肌细胞的凋亡对抗动脉粥样硬化。目的:进一步阐明E1A激活基因阻遏子在内皮细胞凋亡中的作用。方法:通过去血清方法诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,然后进行TUNEL和caspase-3的活性检测。结果与结论:伴随着E1A激活基因阻遏子的表达下降,内皮细胞的凋亡增多。功能获得和功能缺失分析显示:E1A激活基因阻遏子过表达后能够明显抑制内皮细胞的凋亡,而E1A激活基因阻遏子表达减少可以明显增加诱导内皮细胞的凋亡。进一步应用Western blot分析显示:E1A激活基因阻遏子对于内皮细胞凋亡的保护作用主要通过激活PI3K/AKT信号通路介导。提示E1A激活基因阻遏子对抗去血清诱导的内皮细胞凋亡中具有重要的作用。并且,E1A激活基因阻遏子抑制的内皮细胞凋亡可能通过PI3K/AKT信号转导通路。 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 动脉内皮 凋亡 动脉粥样硬化 人脐静脉内皮细胞
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重组人E1A激活基因阻遏子/myc-His融合糖蛋白的纯化及功能鉴定
14
作者 孙鸣宇 韩雅玲 +2 位作者 郭鹏 康建 闫承慧 《中国应用生理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期297-301,I0003,共6页
目的:纯化重组人E1A激活基因阻遏子(hCREG)糖蛋白,验证重组hCREG糖蛋白具有抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖的生物学功能。方法:根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱... 目的:纯化重组人E1A激活基因阻遏子(hCREG)糖蛋白,验证重组hCREG糖蛋白具有抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖的生物学功能。方法:根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。用流式细胞周期分析研究添加0.5μg/ml、1μg/ml及2μg/ml重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。结果:根据6×His亲和层析原理用Ni-NTA纯化重组hCREG蛋白,浓缩并脱盐后的重组hCREG蛋白浓度为1.6mg/ml,纯度为92%,此蛋白仍保留了糖基化形式。流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白可抑制体外培养的HITASY细胞增殖,且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示,添加2μg/ml重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖,组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论:具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的成功纯化,为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平台。 展开更多
关键词 腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子 糖蛋白 蛋白纯化
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E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R(11~13)结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移
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作者 闫承慧 孙鸣宇 +4 位作者 张效林 徐凯 李毅 王效增 韩雅玲 《中国动脉硬化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期961-967,共7页
目的研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用。方法构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG。转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方... 目的研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用。方法构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG。转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方法纯化获得wtCREG和mCREG蛋白;将重组wt-CREG(400 nmol/L)及mCREG蛋白(400 nmol/L),分别加入体外培养的低表达CREG的人血管平滑肌细胞OB2中,应用Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳方法观察两种重组人CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2、4、8 mg/L)的胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF2R)中和抗体与人M6P/IGF2R细胞外结构域蛋白小肽分别进行阻断实验,分析M6P/IGF2R是否参与介导CREG蛋白对平滑肌细胞迁移的调控。结果刮伤实验发现,加入最佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24 h后,OB2组细胞的迁移能力均明显下降;明胶酶电泳和Western blot检测结果也证实,两种重组CREG蛋白均可以使细胞外基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的合成及活性减少,而组织金属蛋白酶抑制物表达则明显增加;同时,Western blot分析也证实,平滑肌细胞分化标志蛋白myocardin、SMα-actin、肌球蛋白重链和caldesmin表达增加,LM-1和FN表达减少。提示两种重组CREG蛋白均能够抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移,促进其分化。IGF2R中和抗体和IGF2R小肽阻断实验证实:不同浓度的Anti-M6P/IGF2R能有效阻断两种CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质合成的调控作用。并且,M6P/IGF2R的第11~13结构域小肽片段对wt/mCREG蛋白的生物学效应也有明显的阻断作用。结论重组CREG蛋白可能通过细胞膜表面M6P/IGF2R的11~13结构域抑制人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质分泌,维持细胞分化。 展开更多
关键词 E1A蛋白 阻遏子 平滑肌细胞迁移
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E1A激活基因阻遏子基因表达与血管外膜成纤维细胞表型转化的关系
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作者 李洋 韩雅玲 闫承慧 《中国介入心脏病学杂志》 2014年第8期509-514,共6页
目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因表达与血管外膜成纤维细胞(AFs)表型转化间的关系。方法制作小鼠颈动脉损伤模型,免疫荧光染色观察血管外膜中CREG与平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;培养小鼠原代AFs,外源性应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ... 目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因表达与血管外膜成纤维细胞(AFs)表型转化间的关系。方法制作小鼠颈动脉损伤模型,免疫荧光染色观察血管外膜中CREG与平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;培养小鼠原代AFs,外源性应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导其表型转化,RT-PCR和Western-blot检测不同作用时间及不同浓度AngⅡ刺激AFs后CREG和α-SMA mRNA和蛋白质表达。结果血管损伤后1 d、3 d血管外膜增生显著,外膜中α-SMA表达显著上调,而CREG表达显著下调;血管损伤后7 d、14 d外膜增生有所缓解,α-SMA表达水平逐渐下降,而CREG表达也有所恢复。应用AngⅡ诱导AFs发生表型转化,AFs中α-SMA mRNA和蛋白水平显著上调,而CREG mRNA和蛋白水平显著下调,并且呈时间和剂量依赖性。结论在体和离体模型均表明AFs表型转化过程中伴随CREG基因表达下调,提示CREG基因可能参与AFs的表型转化。 展开更多
关键词 E1A激活基因阻遏子 血管外膜成纤维细胞 表型转化
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miR-199a-3p靶向视网膜母细胞瘤转录辅阻遏子1促进心肌细胞肥大 被引量:3
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作者 杨静 胡志琴 +6 位作者 朱杰宁 李晖 符永恒 袁淑菁 潘蓉 张梦珍 单志新 《中山大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期23-30,共8页
【目的】探讨微小RNA microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)对心肌细胞肥大的调控作用及其作用靶基因。【方法】原代分离培养C57BL/6乳小鼠心肌细胞(NMVC),转染miR-199a-3p模拟物(mimic)和视网膜母细胞瘤转录辅阻遏子1(Rb-1)siRNA分别来增加N... 【目的】探讨微小RNA microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)对心肌细胞肥大的调控作用及其作用靶基因。【方法】原代分离培养C57BL/6乳小鼠心肌细胞(NMVC),转染miR-199a-3p模拟物(mimic)和视网膜母细胞瘤转录辅阻遏子1(Rb-1)siRNA分别来增加NMVC中miR-199a-3p和抑制Rb-1的水平。双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-3p与潜在靶基因Rb-1 3′端非翻译区(3′-UTR)的结合作用。FITC-鬼笔环肽染色检测乳小鼠心肌细胞表面积。RT-qPCR和Western blot检测miR-199a-3p,Rb-1和心肌细胞肥大相关基因的表达。【结果】①过表达miR-199a-3p可明显增加NMVC中的肥厚相关基因Nppa,Acta1,Myh7表达;②双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-199a-3p与Rb-1 3′UTR具有特异结合作用;miR-199a-3p可在转录后水平抑制Rb-1的表达;③过表达miR-199a-3p或抑制Rb-1表达均能一致性地增加心肌细胞表面积和心肌细胞肥大相关基因表达,并促进E2f2进入NMVC细胞核。【结论】miR-199a-3p通过抑制Rb-1表达,促进了E2f2进入细胞核来发挥促进NMVC肥大的作用。 展开更多
关键词 心肌肥厚 微小RNA microRNA-199a-3p 视网膜母细胞瘤转录辅阻遏子1
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过表达E1A激活基因阻遏子对OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响 被引量:3
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作者 郝晓慧 赵明中 +3 位作者 张玉芝 张祖峰 朱秋平 牛方卿 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2019年第2期258-262,共5页
目的:研究过表达E1A激活基因阻遏子(CREG)对氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:血管内皮细胞分为4组,空白对照组不处理; Ox LDL组用100 mg/L Ox LDL处理24 h;另2组分别感染对照逆转录病毒(阴性对照组)和p LNC... 目的:研究过表达E1A激活基因阻遏子(CREG)对氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:血管内皮细胞分为4组,空白对照组不处理; Ox LDL组用100 mg/L Ox LDL处理24 h;另2组分别感染对照逆转录病毒(阴性对照组)和p LNCX-CREG重组逆转录病毒(p LNCX-CREG组),之后均用100 mg/L OxLDL处理24 h。用Real-time PCR和Western blot法检测4组细胞CREG mRNA和蛋白的表达,用硫代巴比妥酸法检测培养液中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活性,DCFH-DA法检测培养液中活性氧(ROS)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白的表达水平。结果:与空白对照组比较,Ox LDL组细胞中CREG mRNA和蛋白表达水平均降低; p LNCXCREG组细胞中CREG mRNA和蛋白表达水平均较Ox LDL组升高(P <0. 05)。与空白对照组比较,Ox LDL组细胞SOD活性降低,MDA和ROS水平升高,细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高;与Ox LDL组比较,p LNCX-CREG组细胞氧化损伤指标的变化被逆转,细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低(P <0. 05)。结论:过表达CREG可以抑制Ox LDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤并抑制细胞凋亡。 展开更多
关键词 血管内皮细胞 凋亡 E1A激活基因阻遏子 OXLDL
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类固醇受体辅助活化因子-1、核受体辅阻遏子在子宫内膜癌患者中的表达 被引量:2
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作者 柳先廉 杨宇 +3 位作者 霍炽文 郑永娟 唐坤 刘燕燕 《广东医学》 CAS 2018年第S1期42-44,共3页
目的通过检测子宫内膜癌及增殖期子宫内膜的组织中类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)、核受体辅阻遏子(NCoR)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达,观察SRC-1、NCoR与ER、PR之间的关系,探讨其在子宫内膜癌发生、发展中的可能作用。方... 目的通过检测子宫内膜癌及增殖期子宫内膜的组织中类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)、核受体辅阻遏子(NCoR)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达,观察SRC-1、NCoR与ER、PR之间的关系,探讨其在子宫内膜癌发生、发展中的可能作用。方法用免疫组化方法检测40例子宫内膜癌患者的子宫内膜组织(观察组)和30例子宫内膜息肉患者非息肉区的增殖期的子宫内膜组织(对照组)中SRC-1、NCoR与ER、PR的阳性细胞的平均光密度值(IOD)并进行比较。结果 ER、PR在观察组中的表达显著低于对照组(P<0.05);SRC-1在观察组中表达明显高于对照组(P<0.05);NCoR在观察组中表达明显低于对照组(P<0.05)。结论低表达的ER存在时,SRC-1在子宫内膜癌中表达增高,低表达的PR可能降低NCoR的表达,SRC-1表达的增加和NcoR表达的降低可能导致子宫内膜组织增生活性增高,可能与子宫内膜癌变有关。 展开更多
关键词 类固醇受体辅助活化因-1 核受体辅阻遏子 雌激素受体 孕激素受体 宫内膜癌
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肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤
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作者 Yang L 王玮珺 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2019年第5期1134-1134,共1页
【据《Hepatology》2019年1月】报道:肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤(作者 Yang L等)肝缺血再灌注损伤是在肝移植、肝切除手术中不可避免的损伤过程,是肝脏外科手术的一大难题。目前唯一有... 【据《Hepatology》2019年1月】报道:肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤(作者 Yang L等)肝缺血再灌注损伤是在肝移植、肝切除手术中不可避免的损伤过程,是肝脏外科手术的一大难题。目前唯一有效的治疗方案是缺血预处理,但在适应症上存在缺陷。因此,对肝缺血再灌注损伤发病机制的深入了解并开发有效的治疗方法至关重要。E1A激活基因阻遏子(CREG)是细胞增殖的关键调节因子,已有相关文献报道其在心血管疾病中发挥重要的保护作用,同时也可在肝脂质积累和炎症反应中发挥保护作用。然而,其在肝缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。因此,探讨CREG在肝缺血再灌注损伤中的作用可为临床诊疗提供新的思路。 展开更多
关键词 肝缺血再灌注损伤 转化生长因 阻遏子 E1A 肝细胞 基因 激活 小鼠
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