A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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作者 秦文珍 李挺 +11 位作者 赵欣 董苏洁 翟焕杰 叶晨倩 叶曼青 童武 郑浩 于海 单同领 童光志 兰道亮 孔宁 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期195-200,共6页

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重... A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 VP1 原核表达 多克隆抗体

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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

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作者 任建乐 林铱婷 +9 位作者 姬康 谭姗姗 陈新新 晋怡 王颖 牛胜 梁立滨 李俊平 赵宇军 田文霞 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期678-688,共11页

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,... [目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒(SVA) VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 间接ELISA

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羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒感染PK-15细胞活性和机制探究

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作者 张诗悦 张亮 +6 位作者 张伟 陈九 杨少华 高星熠 闫滨 李宝国 杨宏军 《山东农业科学》 北大核心 2024年第4期151-158,共8页

研究羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞的活性及机制。首先采用水提法提取羊栖菜粗多糖,然后用不同孔径超滤膜将粗多糖分为不同分子量段;通过荧光定量PCR测定不同分子量粗多糖抗SVA活性,采用水提醇沉法将抗SV... 研究羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞的活性及机制。首先采用水提法提取羊栖菜粗多糖,然后用不同孔径超滤膜将粗多糖分为不同分子量段;通过荧光定量PCR测定不同分子量粗多糖抗SVA活性,采用水提醇沉法将抗SVA活性最高分子量段的粗多糖进行纯化并测定其细胞毒性及抗SVA活性;通过在SVA感染周期不同阶段给药研究纯化多糖的抗SVA机制。结果表明,分子量越大的粗多糖抗SVA活性越强;多糖浓度和SVA浓度均与抗SVA活性呈现量效关系,纯化后的多糖对SVA(MOI=0.1)感染PK-15细胞的治疗指数为412,1 mg/mL的多糖对SVA(MOI=10-1~104)感染PK-15细胞病毒载量的抑制率在90%~99.999%之间;不同给药时间试验结果表明,多糖能在SVA吸附或穿入细胞以及病毒复制过程发挥抗病毒作用,其中抑制SVA吸附或穿入的活性最强。本研究分离纯化得到的羊栖菜多糖有很强的抗SVA活性,可为后续抗SVA药物的研发提供参考。 展开更多

关键词 羊栖菜多糖 a型塞内卡病毒 提取 纯化 抗病毒

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A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

4

作者 林铱婷 姬康 +8 位作者 谭姗姗 晋怡 宋若琪 马瑞一 王颖 牛胜 赵宇军 田文霞 任建乐 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期96-102,共7页

为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物... 为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物,随后将纯化的VP3重组蛋白皮下多点注射新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot分别对抗体效价、反应性和特异性进行鉴定。结果显示:重组VP3蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 kDa;制备的VP3蛋白多克隆抗体能与VP3重组蛋白和SVA发生特异性反应,其ELISA效价达1:10000以上,Western blot和IFA效价达1:5000。综上,本研究成功制备了SVA VP3多克隆抗体,其具有较高的效价和特异性,可为后续SVA致病机制及检测方法等研究奠定基础。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 VP3蛋白 原核表达 多克隆抗体 效价 特异性

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A型塞内卡病毒序列元件与蛋白功能研究进展

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作者 南福龙 孟海蓝 +3 位作者 李紫薇 沙洲 尼博 刘拂晓 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第2期89-95,共7页

A型塞内卡病毒(SVA)是一种引起猪水疱性疾病的新发病毒。该病毒是小RNA病毒科、塞内卡病毒属的唯一成员。SVA基因组为单股、正链、不分节段的线性RNA,其中间为较长的编码区,共编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白;两端分别为5′和3′非编码... A型塞内卡病毒(SVA)是一种引起猪水疱性疾病的新发病毒。该病毒是小RNA病毒科、塞内卡病毒属的唯一成员。SVA基因组为单股、正链、不分节段的线性RNA,其中间为较长的编码区,共编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白;两端分别为5′和3′非编码区,在病毒复制、启动蛋白表达以及影响病毒毒力等过程中起到了重要的作用。SVA的结构蛋白为VP1、VP2、VP3和VP4,主要参与病毒衣壳的形成;非结构蛋白则与病毒复制和免疫逃逸密切相关。作为一种新发病原体,关于SVA分子机制的研究尚未深入。本文系统地总结了SVA基因组结构和功能的研究进展,为SVA的深入研究,尤其是抗病毒制剂的研制提供参考依据。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 基因 蛋白 结构 功能

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A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

6

作者 翟刚 顾文源 +6 位作者 王晶 刘莹 赵云环 刘涛 张帅 左玉柱 范京惠 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1025-1031,共7页

为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化... 为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为阳性外,其他病毒均为阴性,特异性较强。将SVA阳性血清2倍倍比稀释(1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600)后经该间接ELISA方法检测,评估其敏感性,结果显示,SVA阳性小鼠血清在1∶800稀释后检测结果仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r VP2包被ELISA板,按照该ELISA方法检测8份猪SVA阳性血清,评估该方法的重复性。结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,该方法重复性好。利用本实验建立的间接ELISA方法与血清中和试验同时对266份临床血清样品检测,结果显示,本研究建立方法检测的样品阳性率为19.1%,中和试验检测的样品阳性率为19.55%,两种方法检测结果符合率为97.7%。本研究首次基于SVA r VP2建立的间接ELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,为SVA的检测和其感染的防控提供了可靠的技术支持。 展开更多

关键词 猪 a型塞内卡病毒 VP2 间接ELISA

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抗A型塞内卡病毒天然产物筛选及颉颃作用机制研究

7

作者 蒙英雯 李月华 +6 位作者 沙洲 李晨钰 巩有权 董雅琴 魏荣 邹丰才 尼博 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期734-744,共11页

【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从... 【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从天然产物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的天然产物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过细胞毒性试验确定其最大无毒浓度。选择病毒感染周期的吸附、入胞、复制、组装释放4个主要过程,利用实时荧光定量RT-PCR、50%组织细胞感染量(TCID 50)测定等进行天然产物分子颉颃机制研究。【结果】从包含560种天然产物的分子库中筛选出16种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出4种安全、有效的天然产物,分别为20S-原人参三醇((20S)-protopanaxatriol)、蕈青霉素(paxilline)、方胆碱(fangchinoline)、竹红菌乙素(hypocrellin B)。作用机制研究显示,20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的吸附、复制阶段;蕈青霉素在SVA的吸附、入胞、复制、组装释放阶段即整个病毒感染周期均发挥抑制作用;方胆碱能抑制SVA的入胞、复制;竹红菌乙素能抑制SVA的吸附、入胞、复制及组装释放阶段。【结论】本试验从天然产物库中筛选出了4种具有抗SVA活性的天然产物,这些化合物抗病毒效果良好,且作用机制各有不同。本研究为抗SVA药物的进一步研发提供重要参考。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒(SVA) 天然产物 高通量筛选 颉颃机制

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A型塞内卡病毒感染PK-15细胞环状RNA表达谱分析

8

作者 陈彦希 王晨 +5 位作者 罗愿 周远成 徐志文 彭远义 宋振辉 刘骁 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期280-289,共10页

【目的】分析A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)感染猪肾上皮细胞(PK-15)后环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱的变化,探究circRNAs在SVA感染过程中发挥的潜在调控作用。【方法】本研究基于Illumina HiSeq 2000平台对SVA感染及对照PK... 【目的】分析A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)感染猪肾上皮细胞(PK-15)后环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱的变化,探究circRNAs在SVA感染过程中发挥的潜在调控作用。【方法】本研究基于Illumina HiSeq 2000平台对SVA感染及对照PK-15细胞circRNAs转录组进行测序,并对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能及KEGG通路富集分析,通过实时荧光定量PCR对新发现的circRNAs进行表达水平鉴定。【结果】转录组测序结果显示,SVA感染组、PK-15细胞对照组中共有432种circRNAs被发现。在SVA感染PK-15细胞中,87种circRNAs表达水平相对对照组PK-15细胞显著上调,74种circRNAs表达水平显著下调。对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能注释分析表明,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于核仁、细胞器膜和细胞大分子代谢、发育等生理过程。KEGG通路富集结果显示,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于胞吞过程、cAMP信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路。对6种新发现的显著差异表达的circRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,其表达水平与高通量测序结果趋势一致。【结论】本研究首次对SVA感染PK-15细胞的circRNAs表达谱进行差异分析,发现差异表达的circRNAs广泛参与动物机体大分子代谢、胞吞及细胞增殖、黏附、抗病毒过程,为进一步探究circRNAs在SVA感染过程中的分子机制提供了理论依据。 展开更多

关键词 环状RNA(circRNA) a型塞内卡病毒(SVA) 高通量测序 PK-15细胞

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A型塞内卡病毒胶体金免疫层析抗原检测试纸的研制

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作者 安满鑫 魏子宇 +5 位作者 陈玉潇 吕兰 吴文璇 袁万哲 马明 李丽敏 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期83-88,94,共7页

为建立一种快速检测A型塞内卡病毒的免疫层析方法,本研究制备了SVA VP2蛋白的单克隆抗体,将单克隆抗体1D6作为金标记抗体,以单克隆抗体2C2和羊抗鼠IgG分别作为检测抗体和质控抗体,用双抗体夹心原理制备了试纸条。结果表明,本研究所制备... 为建立一种快速检测A型塞内卡病毒的免疫层析方法,本研究制备了SVA VP2蛋白的单克隆抗体,将单克隆抗体1D6作为金标记抗体,以单克隆抗体2C2和羊抗鼠IgG分别作为检测抗体和质控抗体,用双抗体夹心原理制备了试纸条。结果表明,本研究所制备的2株单克隆抗体均具有良好的免疫活性,1D6和2C2识别不同抗原表位且具有较高的亲和力。基于单克隆抗体1D6和2C2制备的免疫层析试纸条能特异性的检测A型塞内卡病毒且与PRRSV、FMDV和SFV无交叉反应;病毒的最低检测限为4.8×10^(2)TCID_(50)/mL且具有良好的重复性;该方法与RT-PCR方法检测临床样品的一致率为100%。综上所述,本研究制备的SVA胶体金免疫层析试纸具有良好的检测性能,为临床上SVA的防控提供了快速、简便的方法。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 单克隆抗体 免疫层析 快速检测

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RIP3对A型塞内卡病毒复制影响的机制研究

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作者 马潇雨 郭紫晶 +5 位作者 张瑞 王梦瑶 谭小雨 游青 李彦敏 张志东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期604-610,共7页

为探究细胞程序性坏死的关键蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)对A型塞内卡病毒(SVA)复制的影响及其潜在的作用机制,本研究采用SVA(MOI 1)感染PK-15细胞(PK-15+SVA),PK-15细胞作为对照组(Mock),采用western blot检测RIP3、磷酸化的RIP3(... 为探究细胞程序性坏死的关键蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)对A型塞内卡病毒(SVA)复制的影响及其潜在的作用机制,本研究采用SVA(MOI 1)感染PK-15细胞(PK-15+SVA),PK-15细胞作为对照组(Mock),采用western blot检测RIP3、磷酸化的RIP3(P-RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)与磷酸化MLKL(P-MLKL)蛋白表达。结果显示,SVA感染促进PK-15细胞中P-RIP3和P-MLKL蛋白表达量显著增多(P<0.05),表明SVA可激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。利用RIP3特异性抑制剂GSK843处理PK-15细胞(PK-15+SVA+GSK843),在SVA(MOI 1)感染12 h、24 h和48 h后,利用western blot和qPCR检测SVA非结构蛋白3D的表达水平和SVA mRNA(24 h)的转录水平。结果显示,与Mock组相比,感染细胞中SVA 3D蛋白和SVA mRNA转录水平均显著增加(P<0.05)。利用western blot检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达;采用SVA感染敲低自噬蛋白5(ATG5)的PK-15细胞(ATG5 KD),利用western blot检测其中SVA 3D蛋白的表达;利用qPCR检测各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA转录水平。结果显示,与Mock组相比,PK-15+SVA细胞中LC3-I的变化不明显,LC3-II蛋白表达水平明显下调;与PK-15+SVA组相比,PK-15+SVA+GSK843细胞中LC3-I变化不明显,LC3-II蛋白表达水平则明显增加。与SVA感染的PK-15细胞相比,SVA感染ATG5 KD中3D蛋白表达水平明显下降。qPCR结果显示,与未感染SVA的对照组相比,PK-15+SVA中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著上调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001),与PK-15+SVA组相比,PK-15+SVA+GSK843细胞中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著下调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。本研究上述结果首次表明RIP3可调控细胞自噬,影响SVA的复制,并参与调控细胞自噬的发生与炎性细胞因子的转录,该结果为进一步阐明SVA的致病机制及其感染的防治提供重要的科学依据。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 受体相互作用蛋白激酶-3 病毒复制 自噬 程序性坏死

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温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响

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作者 胡振儒 赵司淼 +3 位作者 周回迎 覃尧 冉旭华 闻晓波 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2023年第4期51-58,共8页

A型塞内卡病毒(SVA)作为猪水疱性传染病的病原体之一,日益影响我国生猪养殖业的发展。为探究温度和酸性环境对SVA复制的影响,以CHN/SVA/HB/2018 SVA株作为研究材料,采用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、热点残基、相互作用力等... A型塞内卡病毒(SVA)作为猪水疱性传染病的病原体之一,日益影响我国生猪养殖业的发展。为探究温度和酸性环境对SVA复制的影响,以CHN/SVA/HB/2018 SVA株作为研究材料,采用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、热点残基、相互作用力等进行分析。将SVA病毒液在不同温度(4、25、37℃)及不同pH值(4.0、5.8、6.6、7.2)缓冲液中进行孵育,利用TCID50和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对SVA进行稳定性分析。结果表明:SVA衣壳蛋白在特定条件下具有不稳定性且衣壳蛋白耐热性不高,蛋白质间通过弱相互作用结合而形成病毒颗粒。通过SVA热稳定和酸稳定的试验验证随孵育温度升高或pH值下降,SVA病毒颗粒稳定性显著下降。综上,SVA具有热不稳定性和酸不稳定性,为新型高效疫苗与热稳定保护剂的研发提供一定参考。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 衣壳蛋白稳定性 热稳定 酸稳定

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A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：17

12

作者 张永宁 张舟 +4 位作者 诸明欣 梅琳 王彩霞 吴绍强 林祥梅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期256-263,共8页

本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质... 本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 衣壳蛋白 原核表达 多克隆抗体

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A型塞内卡病毒病原学、流行病学和诊断研究进展 被引量：8

13

作者 刘存 刘畅 +4 位作者 刘琪 王静 李秀博 崔尚金 梁琳 《猪业科学》 2018年第1期104-108,共5页

为了进一步了解A型塞内卡病毒的特征,通过查阅与A型塞内卡病毒相关的文献,对A型塞内卡病毒流行病学、致病性、诊断方法等方面进行综述,以期提高人们对A型塞内卡病毒的认识及防控意识。

关键词 a型塞内卡病毒 新发 小RNA病毒 猪特发性水疱病

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A型塞内卡病毒的流行、诊断与防控 被引量：4

14

作者 张传亮 《中国畜牧兽医文摘》 2018年第6期414-414,共1页

A型塞内卡病毒是一种新兴的微RNA病毒,主要感染猪,不同性别和年龄阶段的猪均易感,最近认为其是引起猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因,可导致感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变,新生仔猪死亡。文章对A型塞内卡病毒的病原学、流行病学、... A型塞内卡病毒是一种新兴的微RNA病毒,主要感染猪,不同性别和年龄阶段的猪均易感,最近认为其是引起猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因,可导致感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变,新生仔猪死亡。文章对A型塞内卡病毒的病原学、流行病学、临床症状与病理变化、诊断、防控等内容作一概述,以期为制定SVA防控方案提供参考。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 流行 诊断 防控

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基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：11

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作者 申水莹 闫若潜 +6 位作者 雷从从 王淑娟 马震原 刘影 赵雪丽 谢彩华 吴志明 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第2期23-30,共8页

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴... 【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组VP3蛋白(rVP3)作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证。将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清,分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测,对比两者检测结果。【结果】成功克隆717 bp的VP3基因,表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白(rVP3)。Western Blot试验结果表明,纯化的rVP3蛋白具有良好的反应原性。建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,当样本OD 450(S)/阳性对照OD 450(P)>0.138时判定为SVA抗体阳性。该方法特异性强,与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应;敏感性较好,检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致;重复性和稳定性好,批内变异系数小于4%,批间变异系数小于9%。160份血清检测结果表明,两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异。【结论】建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 VP3蛋白 间接ELISA 病毒检测

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A型塞内卡病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用 被引量：6

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作者 杨钰楚 王晨曦 +3 位作者 周雪珂 赵军 徐志文 朱玲 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期868-873,共6页

为建立一种利用逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,从SVA细胞培养液中提取总RNA,根据SVA VP1基因序列,设计一套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP检测方法。利用建立的RT-L... 为建立一种利用逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,从SVA细胞培养液中提取总RNA,根据SVA VP1基因序列,设计一套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP检测方法。利用建立的RT-LAMP检测方法对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒与塞内卡病毒进行特异性试验。将SVA VP1质粒10倍梯度稀释液作为模板(1×10~0~1×10~7拷贝)进行RT-LAMP和RT-PCR反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。采集疑似发病猪的鼻腔拭子和水疱液共126份样品,应用RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化鉴定。结果表明,与传统RT-PCR相比,RT-LAMP检测方法灵敏度高1 000倍,且与其他病毒无交叉反应,具有高度敏感性和特异性。临床样品检测结果显示,鼻腔拭子样本SVA阳性率为29.6%,水疱液样本SVA阳性率为100.0%,2种方法检测结果一致,符合率为100%。综上所述,本研究建立的RT-LAMP检测方法准确、简便、经济有效,尤其适用于现场和基层实验室对SVA的快速诊断。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 RT-LAMP 快速检测

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A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及免疫原性分析 被引量：4

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作者 崔川 刘佳欢 +3 位作者 韩伟建 张俊娟 张义明 李丽敏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第6期91-98,共8页

为研究A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白的生物学特性,本试验对GenBank公布的SVA VP2基因序列分析筛选,合成完整VP2基因序列。使用Expasy软件对其结构进行分析,通过原核表达VP2蛋白并利用正交设计优化其可溶性表达条件,纯化VP2蛋白免疫獭兔、... 为研究A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白的生物学特性,本试验对GenBank公布的SVA VP2基因序列分析筛选,合成完整VP2基因序列。使用Expasy软件对其结构进行分析,通过原核表达VP2蛋白并利用正交设计优化其可溶性表达条件,纯化VP2蛋白免疫獭兔、小鼠,检测血清中特异性抗体和细胞因子的变化。结果显示:SVA VP2蛋白的一、二级结构得以展示;成功表达了可溶性的VP2蛋白,可溶性蛋白表达最佳条件为培养转速120 rpm、诱导时间8 h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L;制备了高效价的兔源多克隆抗体;在免疫VP2蛋白的小鼠血清中检测到高水平的VP2特异性抗体且IFN-γ和IL-2水平显著升高,表明VP2蛋白具有良好的免疫原性。本研究为进一步塞内卡病毒VP2蛋白功能及应用研究提供了技术支持。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 VP2基因 免疫原性 细胞因子 正交设计

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猪A型塞内卡病毒分离鉴定及其VP1基因变异分析 被引量：1

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作者 李秀博 刘存 +3 位作者 崔玉东 梁琳 张建伟 崔尚金 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1747-1752,共6页

2017年7月,南方某猪场发生不明病原引起的猪水疱性疾病。为了确诊本次水疱性疾病的病因及了解病原的遗传演化关系,笔者通过RT-PCR方法对引起该场水疱性疾病的病原进行检测,利用BHK21细胞分离病毒,RT-PCR、电镜观察等方法对分离病毒进行... 2017年7月,南方某猪场发生不明病原引起的猪水疱性疾病。为了确诊本次水疱性疾病的病因及了解病原的遗传演化关系,笔者通过RT-PCR方法对引起该场水疱性疾病的病原进行检测,利用BHK21细胞分离病毒,RT-PCR、电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定,同时对其主要的抗原基因VP1进行比对分析。RT-PCR检测结果表明导致该猪场发生水疱性疾病的病原为A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA),将利用BHK21细胞分离并经鉴定的病毒命名为CH/FuJ1/2017株。同源性分析结果显示,CH/FuJ1/2017株与报道的SVV-001株的相似性最低,与分离自美国的USA-GBI29-2015株的相似性最高。基于SVA VP1基因氨基酸序列的分析结果表明,SVA分离株形成一个独立的小分支,与SVV-001株相比,SVA分离株在VP1蛋白的59、62、63、93、97、172位氨基酸存在突变,且位于VP1蛋白的B-C环上和CD-Ⅱ环上,这可能与SVA的细胞嗜性改变有关。综上表明我国SVA分离株具有遗传多样性,部分国内分离株与国外SVA分离株间具有密切的相关性。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 分离 VP1 遗传演化

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A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

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作者 郭金硕 侯磊 +3 位作者 全荣 王菁 韦莉 刘爵 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2022年第3期20-24,共5页

为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋... 为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 VP1蛋白 杂交瘤细胞 单克隆抗体

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A型塞内卡病毒研究进展 被引量：5

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作者 肖佳旭 郭笑然 +1 位作者 赵款 袁万哲 《动物医学进展》 北大核心 2022年第4期69-74,共6页

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是近年来新发的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,为小RNA病毒科塞内卡病毒属唯一成员。据报道,该病先后在加拿大、美国、巴西、泰国等国家流行,2015年SVA首次在我国广东省检出,随后多个省、自治区... A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是近年来新发的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,为小RNA病毒科塞内卡病毒属唯一成员。据报道,该病先后在加拿大、美国、巴西、泰国等国家流行,2015年SVA首次在我国广东省检出,随后多个省、自治区和直辖市均检测到SVA阳性病例,可见SVA已经在我国流行。猪感染SVA后能够引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂,严重者甚至出现死亡,其临床症状与口蹄疫、猪水疱病非常相似,难以进行辨别。该病目前尚无商品化疫苗,但已有灭活疫苗、减毒活疫苗以及病毒样颗粒疫苗研究的报道。论文对塞内卡病的病原学、流行病学、致病机理、诊断以及疫苗研究等方面进行概述,为深入研究和防控该病提供理论依据。 展开更多

关键词 a型塞内卡病毒 流行病学 致病机理 诊断

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