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题名犬瘟热病毒CDV-3株感染性克隆的构建与鉴定
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作者
卜研
闫喜军
赵建军
李海涛
赵传芳
薛向红
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机构
中国农业科学院特产研究所
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出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第1期178-186,共9页
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基金
国家自然科学基金(No.31902275)
国家重点研发计划(No.2016YFD0501001)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(No.1610342020017)资助
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文摘
以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性c DNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础。设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增。经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pc DNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得CDV-3株的全长c DNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3)。构建表达CDV-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒。利用转染试剂LipofectamineTM 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3 d后,将上清接种到Vero细胞。观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定。最后,比较wtCDV-3和rCDV-3的生长特性。全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确。拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rCDV-3株。rCDV-3的病毒滴度最高达到107.667 TCID50/mL,比wtCDV-3的滴度106.667 TCID50/mL高出约10倍。rCDV-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度。而wt CDV-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大。文中建立的高效CDV-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础。
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关键词
犬瘟热病毒
cdv-3株
感染性克隆
反向遗传系统
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Keywords
canine distemper virus
cdv-3 strain
infectious clone
reverse genetic system
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分类号
S852.65
[农业科学—基础兽医学]
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