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重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析 被引量：1
1
作者 千爱君 萧耿苗 +4 位作者 李壮 梁志成 穆云萍 赵子建 李芳红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期390-396,共7页
目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,... 目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。 展开更多
关键词 重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白 真核表达 悬浮cho-s细胞 cAMP活性 基因工程 脂代谢
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重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定 被引量：1
2
作者 邓木兰 周泓宇 +7 位作者 郑可欣 李昭阳 郭婉怡 王艳苹 梁志成 李芳红 穆云萍 赵子建 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期774-781,共8页
目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖... 目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。 展开更多
关键词 重组人α-半乳糖苷酶 法布雷病 酶替代疗法 悬浮cho-s细胞 溶酶体贮积症 基因工程
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猪源IFN-λ3在CHO-S细胞中的表达及其抗口蹄疫病毒活性分析
3
作者 袁红 白兴文 +8 位作者 李坤 李平花 孙普 宋雅丽 焦云娟 刘在新 卢曾军 李冬 包慧芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期190-196,共7页
为了探究猪源IFN-λ3蛋白能否在CHO-S悬浮细胞中表达以及表达蛋白的抗口蹄疫病毒(FMDV)活性,根据NCBI上的猪源IFN-λ3序列,构建真核表达载体pcDNA3.4-IFNλ3-His,将其转染至CHO-K1贴壁细胞中,用间接免疫荧光试验和Western-blot验证重组... 为了探究猪源IFN-λ3蛋白能否在CHO-S悬浮细胞中表达以及表达蛋白的抗口蹄疫病毒(FMDV)活性,根据NCBI上的猪源IFN-λ3序列,构建真核表达载体pcDNA3.4-IFNλ3-His,将其转染至CHO-K1贴壁细胞中,用间接免疫荧光试验和Western-blot验证重组质粒是否表达IFN-λ3蛋白。将pcDNA3.4-IFNλ3-His转染至CHO-S悬浮细胞中大量制备IFN-λ3蛋白,用AKTA蛋白纯化系统纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定纯化出的蛋白,用细胞毒性试验分析纯化蛋白是否具有细胞毒性,用实时荧光定量PCR、Western-blot和空斑试验三种方法研究纯化蛋白的抗FMDV活性。结果显示,重组质粒pcDNA3.4-IFNλ3-His在CHO-K1细胞中瞬时表达IFN-λ3,在CHO-S细胞中以分泌形式表达IFN-λ3;用AKTA系统能够纯化出纯度较高的IFN-λ3蛋白;纯化出的IFN-λ3对PK-15细胞无明显毒性,能够抑制FMDV RNA的复制、减弱病毒蛋白翻译活动以及降低子代病毒的生成。本研究为发展新型FMDV防控策略提供了新方向。 展开更多
关键词 猪源IFN-λ3 表达 cho-s细胞 口蹄疫病毒 抗病毒活性
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人源化抗RSV病毒抗体在CHO-S细胞中的高效表达 被引量：1
4
作者 刘春磊 陈习平 +2 位作者 李娜娜 黄琴蓉 寇天赐 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期184-186,共3页
为了有效预防及治疗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染引起的疾病,在CHO-S细胞中表达了人源化抗RSV病毒抗体。以pCHO1.0为载体,分别通过Eco RⅤ(5')和PacⅠ(3')、AvrⅡ(5')和Bst Z17Ⅰ(3')双酶切,... 为了有效预防及治疗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染引起的疾病,在CHO-S细胞中表达了人源化抗RSV病毒抗体。以pCHO1.0为载体,分别通过Eco RⅤ(5')和PacⅠ(3')、AvrⅡ(5')和Bst Z17Ⅰ(3')双酶切,将轻、重链克隆进载体,采用电转的方法,将构建好的质粒转染进CHO-S宿主细胞,通过嘌呤霉素和甲氨蝶呤压力筛选以及有限稀释法,获得能稳定表达抗体的单克隆细胞株。在摇瓶中进行仅补加葡萄糖的流加培养试验,CHO-S细胞在培养7 d时活细胞密度达到最大,为1.3×10~7 cells/ml,在培养12 d时细胞活性降低至80%以下,结束培养,最终抗体表达水平达到130 mg/L,上清液中抗体总活性达到2.90×10~5 IU/ml。经蛋白A亲和色谱纯化,抗体纯度达到98%以上。 展开更多
关键词 抗呼吸道合胞病毒抗体 cho-s细胞 表达
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拟人参皂甙F11减轻吗啡引起的CHO—μ[^35S]GTPγS结合增强的作用 被引量：1
5
作者 李竹 熊英 等 《中国药理学会通讯》 2000年第2期33-33,共1页
关键词 拟人参皂甙F11 吗啡 cho-μ细胞 [^35S]GTPγS 中药
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HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发 被引量：1
6
作者 崔亚敏 田晓平 +3 位作者 孙静静 王志强 赵巧辉 李桂林 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3887-3898,共12页
为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真... 为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。 展开更多
关键词 人鼠嵌合IgM抗体 cho-s细胞 构建工艺 表达
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人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定
7
作者 杨漾 黄亮 +1 位作者 王娜 周剑峰 《中华全科医学》 2011年第5期667-669,F0003,共4页
目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体(hCD123 CDS-pEGFP-N1);经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和... 目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体(hCD123 CDS-pEGFP-N1);经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为(97.94±1.93)%和(2.84±1.35)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 人CD123 稳定表达 cho-s细胞株 细胞筛选
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阻断剂单克隆抗体制备及表达工艺优化
8
作者 崔亚敏 李昕益 +5 位作者 田晓平 孙静静 宋子博 周雷鸣 赵巧辉 李桂林 《生物技术》 CAS 2023年第5期551-557,共7页
[目的]体外制备阻断剂单克隆抗体,并对表达工艺进行优化。[方法]通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞抗体基因序列,经分子克隆构建至真核表达载体pCHO1.0,在CHO-S细胞中构建稳定表达细胞株;运用DOE实验设计方法,筛选最佳培养基、培养温度及... [目的]体外制备阻断剂单克隆抗体,并对表达工艺进行优化。[方法]通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞抗体基因序列,经分子克隆构建至真核表达载体pCHO1.0,在CHO-S细胞中构建稳定表达细胞株;运用DOE实验设计方法,筛选最佳培养基、培养温度及补料方式;在5 L生物反应器进行工艺验证,蛋白A亲和纯化后用化学发光法进行阻断性能验证。[结果]目的基因序列钓取成功,稳定表达单克隆细胞株11H7表达量为2.90 g/L;使用CHO Max A培养基、梯度补料策略、32℃培养可将表达量提升至5.28 g/L,5 L生物反应器表达量为5.47 g/L,纯度均>95%,且在磁微粒G17和ProGRP项目异常样本中检测满足阻断性能需求。[结论]阻断剂单克隆抗体构建成功,通过表达工艺优化,表达量由2.90 g/L提升至5.28 g/L,且在生物反应器中得到初步验证。 展开更多
关键词 阻断剂单克隆抗体 cho-s细胞 稳定细胞株 DOE实验设计 生物反应器
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杆状病毒GP64蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1
9
作者 王妍 王娟 +6 位作者 邓跃 张超林 苏晓蕊 王同燕 李向东 谭菲菲 田克恭 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期576-581,共6页
为研究杆状病毒GP64蛋白在感染宿主过程中的表达情况,通过克隆构建含GP64基因的重组质粒,在CHO-S细胞表达重组GP64蛋白,利用野生型杆状病毒免疫BALB/c小鼠血清,筛选出重组GP64蛋白的单克隆抗体。结果表明,构建出正确的GP64重组质粒,成... 为研究杆状病毒GP64蛋白在感染宿主过程中的表达情况,通过克隆构建含GP64基因的重组质粒,在CHO-S细胞表达重组GP64蛋白,利用野生型杆状病毒免疫BALB/c小鼠血清,筛选出重组GP64蛋白的单克隆抗体。结果表明,构建出正确的GP64重组质粒,成功表达出GP64蛋白,筛选出1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞5B1;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单抗亚类为IgG2b,轻链类型为κappa;IFA和Western-blot结果显示筛选出的GP64单克隆抗体可以与杆状病毒及GP64蛋白发生特异性结合。结论,GP64蛋白的单克隆抗体制备成功。 展开更多
关键词 杆状病毒 GP64蛋白 cho-s细胞 单克隆抗体
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