正交设计优化电转染CHO细胞的方法 被引量：1

1

作者 陆俭 李萍 +2 位作者 马亚茹 陈勇 蒋琳 《生物技术通讯》 CAS 2011年第5期713-716,共4页

目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:... 目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:CHO-dhfr-细胞电转染的优化参数为低离子强度Tris-Cl缓冲液、750 V/cm、50μF、电击2次、间隔1 min,各因素对转染的影响大小依次为缓冲液、电场强度、脉冲次数、电容。结论:确定了电穿孔法转染CHO-dhfr-细胞的方法,为进一步应用该细胞株表达重组蛋白打下了基础。 展开更多

关键词 电穿孔法 cho-dhfr-细胞 正交设计

下载PDF 职称材料

GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达

2

作者 李臻 夏峰 张远强 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期6-11,共6页

目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选... 目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上GPI锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果:构建了阅读框完整的GPI锚固型Met-RANTES嵌合分子,经测序是正确的,并在CHO-DHFR-细胞膜上稳定表达。结论:在CHO细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白,GPI锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中,抑制移植排斥反应。 展开更多

关键词 GPI锚 Met-RANTES cho-dhfr-细胞 真核表达

下载PDF 职称材料

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

3

作者 舒东 俞炜源 +2 位作者 赵志玲 徐兵 罗深秋 《生物技术通讯》 CAS 1999年第2期109-113,共5页

采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细... 采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细胞株 ,溶解圈法测定融合蛋白的表达水平为每 1 0 6细胞每天 5 8IU。该融合蛋白保留了与纤维蛋白的结合活性和溶解纤维蛋白的溶纤活性。SDS- PAGE,Western印迹法分析证明融合蛋白的相对分子质量约为 70× 1 0 展开更多

关键词 单链抗体 低分子量尿激酶 融合蛋白 cho-dhfr-细胞

下载PDF 职称材料

三种病毒启动子在中国地鼠卵巢(CHO)细胞中表达活性的比较 被引量：9

4

作者 刘文军 杨芙蓉 +2 位作者 阮力 任贵方 朱既明 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第2期164-168,共5页

三种病毒启动子在中国地鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中表达活性的比较刘文军杨芙蓉阮力任贵方朱既明（中国预防医学科学院病毒学研究所北京１０００５２）关键词ＣＨＯｄｈｆｒ－细胞，启动子，瞬时表达，ＨＢｓＡｇ基因，ＣＡＴ基因目前大多... 三种病毒启动子在中国地鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中表达活性的比较刘文军杨芙蓉阮力任贵方朱既明（中国预防医学科学院病毒学研究所北京１０００５２）关键词ＣＨＯｄｈｆｒ－细胞，启动子，瞬时表达，ＨＢｓＡｇ基因，ＣＡＴ基因目前大多数哺乳动物细胞表达载体中的启动子－... 展开更多

关键词 乙型肝炎 表面抗原 CHO 病毒 启动子 基因表达

下载PDF 职称材料

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达 被引量：12

5

作者 李风知 李秀珍 +6 位作者 唐宏娣 张宏权 胡宝成 韩素文 俞炜源 方继明 黄翠芬 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1991年第2期114-119,共6页

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV_2-proUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV_2-dhfr或MMTV-dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氢叶酸还原酶基因... 通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV_2-proUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV_2-dhfr或MMTV-dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氢叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr^+)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为241U/10~6细胞/48h,16IU/10~6细胞/48h。用ELISA测定CLF-14和CLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P/N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0.14—0.22μg/10~6细胞/48h和0.08—0.14μg/10~6细胞/48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。 展开更多

关键词 尿激酶原cDNA 仓鼠卵巢 基因表达

下载PDF 职称材料

GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达 被引量：3

6

作者 于继云 沈倍奋 +4 位作者 黎燕 陈兴 程绍辉 田蓉 曲梅花 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期212-214,共3页

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质... 目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。 展开更多

关键词 CTLA4IG 蛋白质表达 糖基化磷脂酰肌醇 CHO-dhfr^-细胞

原文传递

牛朊蛋白在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达 被引量：4

7

作者 丁耀忠 张杰 +6 位作者 刘永生 陈豪泰 曾巧英 马丽娜 马艳平 杨生海 殷宏 《江西农业学报》 CAS 2009年第4期101-103,共3页

从T载体上得到的目的基因和dhfr共扩增基因真核表达载体构建了pCI-PrP102。纯化后的重组质粒通过脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经MTX加压筛选获得稳定表达的细胞株,间接免疫荧光试验检测到目的蛋白的表达。

关键词 牛朊蛋白 二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞 稳定表达

下载PDF 职称材料

低温细胞生存系统长期保存CHO细胞的初步研究 被引量：3

8

作者 徐波 向青 +4 位作者 徐梅 房青 李红艳 靳耀英 唐劲天 《中国康复理论与实践》 CSCD 2004年第11期652-653,共2页

目的验证基因工程细胞空间搭载系统在低温 ( 18℃ -3 0℃、无源等条件下保存细胞的可行性 ,观察此系统对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法将CHO (dhfr-)生物工程细胞株在空间搭载系统中培养 2 5d后 ,利用光镜、MTT法、FCM分... 目的验证基因工程细胞空间搭载系统在低温 ( 18℃ -3 0℃、无源等条件下保存细胞的可行性 ,观察此系统对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法将CHO (dhfr-)生物工程细胞株在空间搭载系统中培养 2 5d后 ,利用光镜、MTT法、FCM分析、3 H掺入法及染色体分析观察细胞生长特性。结果细胞低温培养 2 5d后 ,CHO(dhfr-)细胞呈多种形态 ;细胞周期变化差异不显著 ;染色体无断裂 ;细胞生长速度显著减慢 ;大分子生物合成显著增加。结论空间搭载系统搭载CHO(dhfr-)细胞进入空间后 ,虽然细胞产生了许多生理性变化 ,但能使CHO(dhfr-)细胞生存下来。利用空间搭载系统搭载细胞是完全可行的。 展开更多

关键词 低温 空间搭载系统 CHO(dhfr^-)细胞 生长特性

下载PDF 职称材料

人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用 被引量：2

9

作者 王欢 刘琼琼 +8 位作者 唐小军 徐鑫 褚楚 熊四平 郑峰 童华 朱进 冯振卿 林红 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期863-869,882,共8页

目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体p... 目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体pWS-anti-TROP2,转染CHO dhfr-细胞,加MTX筛选抗体表达量高的单克隆株,Protein G亲和柱纯化,获得人源抗TROP2全分子抗体IgG。SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫荧光和流式细胞术等方法鉴定人源抗TROP2全分子抗体IgG并分析其免疫学活性。MTT法分析人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞BxPC-3的增殖抑制作用。结果:成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,表达并纯化人源抗TROP2全分子抗体IgG。经鉴定,抗体的轻链与重链大小与预期一致,可与TROP2蛋白特异性结合,效价可达1∶6 400。MTT检测结果表明,人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌BxPC3细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈时效、量效依赖关系。结论:本研究成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,并证明此抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的TROP2蛋白,且对胰腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用。 展开更多

关键词 TROP2 真核表达系统 CHO dhfr-细胞 胰腺癌

原文传递

糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达 被引量：2

10

作者 张淑敏 畅继武 +3 位作者 随志方 李振莉 马富玲 王馨 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期532-534,539,共4页

目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检... 目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。 展开更多

关键词 GPI-B7-1 CHO/DHFR^-细胞 真核表达

下载PDF 职称材料

人α防御素的稳定表达和活性鉴定 被引量：2

11

作者 刘娟 翟嵩 +4 位作者 杜德伟 王临旭 王少扬 汪定成 孙永涛 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第2期178-181,共4页

目的:制备有较高生物学活性的分泌型人α防御 素1与α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性;方法:将真核表 达质粒pcDNA3.1/V5 His TOPO HNP1,3与含有dhfr基因的 质粒pDCH1P11共转染入CHO dhfr ,ELISA检测到培养上清 ... 目的:制备有较高生物学活性的分泌型人α防御 素1与α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性;方法:将真核表 达质粒pcDNA3.1/V5 His TOPO HNP1,3与含有dhfr基因的 质粒pDCH1P11共转染入CHO dhfr ,ELISA检测到培养上清 中重组蛋白的表达,对阳性表达的细胞进行G418筛选,对其 中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压扩 增,ELISA法、RT PCR法及间接免疫荧光(IFA)分析蛋白表 达情况,并同步测定其体外抗菌活性.结果:α防御素1的表 达量是18.85～47.46mg/L·48h·106个细胞;α防御素3 的表达量是16.89～35.57mg/L·48h·106个细胞.用RT PCR从稳定表达的细胞株中扩增出全长约303bp的片段; IFA显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光;K B 纸片琼脂扩散法显示α防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上 形成了明显的抑菌圈.结论:成功高效地表达了分泌型的α 防御素1,3,并具有良好的生物学活? 展开更多

关键词 人α防御素 CHO-dhfr 细胞 甲氨喋呤

下载PDF 职称材料

太空环境改变生物工程细胞CHO(dhfr^-)的生长特性 被引量：1

12

作者 徐梅 向青 +4 位作者 房青 李红艳 徐波 高福云 唐劲天 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第11期22-25,共4页

目的 :了解太空诱变对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法 :将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 1 8颗返回式卫星 ,经 1 8天太空飞行 ,回收后对存活细胞进行单克隆化 ,获得 1 5 9株单克隆细胞。选取生长快、慢不同的 3株... 目的 :了解太空诱变对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法 :将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 1 8颗返回式卫星 ,经 1 8天太空飞行 ,回收后对存活细胞进行单克隆化 ,获得 1 5 9株单克隆细胞。选取生长快、慢不同的 3株克隆 ,利用光镜、MTT法、FCM分析及3 H掺入法观察细胞生长特性。结果 :经太空诱变后 ,CHO(dhfr-)细胞呈多种形态 ;G1期细胞显著增多 ;生长速度和大分子生物合成呈现多向性变化 ,无特定规律性。结论 :太空环境可影响生物工程细胞CHO(dhfr-)的生长特性 ,为进一步筛选优化的生物工程细胞提供了可能。 展开更多

关键词 CHO 细胞 单克隆 改变 MTT法 光镜 生物工程 生长特性 太空诱变 生长速度

下载PDF 职称材料

一种新型HBsAg真核表达载体的构建 被引量：1

13

作者 孔双泉 时成波 +4 位作者 单连慧 张连忠 李洋 杨亦代 盛军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2004年第4期211-213,共3页

目的　在CHO细胞中高效表达HBsAg。方法　通过PCR方法扩增出S和dhfr基因片段 ,分别克隆到T载体上。然后分别将S和dhfr基因克隆到pCI载体上 ,构建pCI S dhfr真核表达载体。转染CHO(dhfr )细胞 ,并用ELISA方法检测HBsAg表达量。结果　S和d... 目的　在CHO细胞中高效表达HBsAg。方法　通过PCR方法扩增出S和dhfr基因片段 ,分别克隆到T载体上。然后分别将S和dhfr基因克隆到pCI载体上 ,构建pCI S dhfr真核表达载体。转染CHO(dhfr )细胞 ,并用ELISA方法检测HBsAg表达量。结果　S和dhfr基因经测序与Genbank报道一致。PCR和测序结果与预期一致。转染后检测结果呈阳性。结论　已成功构建在CHO(dhfr )细胞中高效表达的pCI S 展开更多

关键词 HBSAG 真核表达载体 CH0 细胞 PCR 基因克隆

下载PDF 职称材料

用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究 被引量：1

14

作者 李建民 陈薇 +4 位作者 贾秀杰 安小平 李冰 樊英茹 童贻刚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期312-315,318,共5页

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以... 目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础? 展开更多

关键词 定点整合 FRT CHO/dhfr^-细胞 基孔肯亚病毒 嵌合抗体

原文传递

截短型人骨保护素在CHO-DHFR^-细胞中的表达及活性测定 被引量：1

15

作者 阚伯红 藏晓怡 +1 位作者 李兰英 赵孔银 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1002-1004,共3页

目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG,实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达,获取生物活性较高的重组蛋白。方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG,按LipofectamineTM2000试剂盒说... 目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG,实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达,获取生物活性较高的重组蛋白。方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG,按LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染CHO-DHFR-细胞,以含50 mL/L透析血清的IMDM培养基培养,氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达细胞株,ELISA法和RT-PCR法测定重组蛋白和基因的表达,并采用破骨细胞样细胞(OLC)诱导分化抑制实验测定重组蛋白的体外活性。结果:重组蛋白的表达量最高可达6 mg/L.72 h,且能够明显抑制OLC生成(P<0.05)。结论:截短型人OPG在CHO-DHFR-细胞中成功高效表达,并具有良好的生物学活性,为进一步的实验研究和临床应用提供了基础。 展开更多

关键词 骨保护素 CHO—DHFR-细胞 表达 活性分析

原文传递

CD137(人4-1BB)在dhfr-CHO中的表达及活性研究 被引量：2

16

作者 万兵 张利宁 +4 位作者 马春红 宋静 曹英林 李长菲 孙汶生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期678-681,共4页

目的 :构建CD137真核高效表达系统 ,深入研究CD137及其配体在细胞信号转导中的作用。方法 :将构建有CD137全长cDNA序列的pCDNA3质粒 (CMV ILA SEN ,CIS)及pSV2 dhfr(含二氢叶酸还原酶基因 ) ,运用脂质体介导法共转染二氢叶酸还原酶缺陷... 目的 :构建CD137真核高效表达系统 ,深入研究CD137及其配体在细胞信号转导中的作用。方法 :将构建有CD137全长cDNA序列的pCDNA3质粒 (CMV ILA SEN ,CIS)及pSV2 dhfr(含二氢叶酸还原酶基因 ) ,运用脂质体介导法共转染二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞 (dhfr CHO) ;用G4 18筛选出阳性克隆 ;MTX压力选择系统诱导CD137在dhfr CHO细胞的高效表达 ;RT PCR、免疫细胞化学法及流式细胞术测定CD137的表达情况 ;3H TdR掺入法进行活性研究。结果 :CD137为膜型表达 ,CIS转化dhfr CHO细胞CD137表达率为 96 0 7% ;活性研究显示CD137膜蛋白轻度促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖。结论 :获得高效表达CD137的CHO细胞株 ,CD137膜蛋白促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖。 展开更多

关键词 共刺激分子 CD137 真核表达系统 dhfr-CHO

下载PDF 职称材料

proUK-KGDW融合基因在CHO细胞中的高表达 被引量：2

17

作者 杜韫 刘志刚 +2 位作者 林建波 徐桂清 俞炜源 《生物技术通讯》 CAS 2005年第4期384-386,共3页

利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水... 利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水平,经2～3轮MTX加压扩增,获得多株表达水平超过10μg/(106细胞·24h)的稳定的高表达细胞株,为proUK-KGDW杂合体的制备及功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 proUK—KGDW融合基因 CHO/dhfr^-细胞 重组蛋白 高表达

下载PDF 职称材料

定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立 被引量：1

18

作者 许凌峰 刘志刚 +4 位作者 孙志伟 林建波 杜韫 刘姗 俞炜源 《生物技术通讯》 CAS 2005年第6期605-608,共4页

构建重组载体质粒pMCEfrt-Bcl-2,利用FIp-InTM定点重组系统,在CHO-dhfr-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNALadder检测在高NH4Cl条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血... 构建重组载体质粒pMCEfrt-Bcl-2,利用FIp-InTM定点重组系统,在CHO-dhfr-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNALadder检测在高NH4Cl条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO-Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO-Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15%的活细胞比例,细胞总数高25%。CHO-Bcl-2在高NH4+(50mmol/L)培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO/dhfr-细胞株。 展开更多

关键词 CHO/dhfr^-细胞 BCL-2基因 细胞培养 凋亡

下载PDF 职称材料

HBsAg真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量：1

19

作者 张艳 时成波 +1 位作者 郭丽 范洪学 《中国实验诊断学》 2007年第10期1287-1289,共3页

目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-α... 目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-αS-dhfr真核表达载体进行酶切和测序鉴定。用脂质体法转染CHO(dhfr-)细胞,并用ELISA法检测HBsAg表达。结果hEF-1α启动子、S基因和dhfr基因经测序与Genbank报道一致。真核表达载体pEF1-αS-dhfr经酶切鉴定与预期一致。转染重组质粒后的CHO细胞成功表达了HBsAg。结论已成功构建了真核表达载体pEF1-αS-dhfr,为研究高效表达HBsAg奠定了良好的实验基础。 展开更多

关键词 真核表达载体 CHO细胞 人延伸因子启动子 乙肝表面抗原 二氢叶酸还原酶基因

下载PDF 职称材料

hsBLyS基因在中国仓鼠卵巢细胞中的表达及其在免疫小鼠中诱发的抗体反应

20

作者 吴海涛 吴玉蓉 +4 位作者 胡云龙 刁振宇 金丽娜 李洁 张双全 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第1期130-137,共8页

为建立稳定表达人可溶性B淋巴细胞刺激因子(hsBLyS)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系,从人胎盘cDNA文库中扩增hsBLyS基因,将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和hsBLyS基因重叠延伸为融合基因;融合基因分别插入pcDNA3、pcDNA3.1、pEFneo质粒;磷... 为建立稳定表达人可溶性B淋巴细胞刺激因子(hsBLyS)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系,从人胎盘cDNA文库中扩增hsBLyS基因,将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和hsBLyS基因重叠延伸为融合基因;融合基因分别插入pcDNA3、pcDNA3.1、pEFneo质粒;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSVdhfr,共转染CHOdhfr细胞;选择培养液筛选,经氨甲喋呤选择压力扩增表达,获稳定表达hsBLyS的细胞系,表达量由0.13μg/ml上升至0.55μg/ml;同时利用pEFneo/hsBLyS重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测结果表明小鼠产生hsBLyS的特异性抗体。本实验建立了稳定表达hsBLyS的CHO细胞系,对其基因免疫小鼠抗体产生的特点做了初步探讨。 展开更多

关键词 HSBLYS 中国仓鼠 卵巢细胞 真核分泌表达 基因免疫 抗体反应

下载PDF 职称材料