目的探讨DNase处理法结合微滴化数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在检测冷冻食品中活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)副溶血性弧菌的适用性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较。方法用无菌磷酸盐缓冲液对解...目的探讨DNase处理法结合微滴化数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在检测冷冻食品中活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)副溶血性弧菌的适用性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较。方法用无菌磷酸盐缓冲液对解冻的大西洋鲑鱼样品进行10倍梯度稀释,再加入副溶血性弧菌,终浓度为6.6×10^5 CFU/mL。-20℃分别诱导10、20和30 d。将DNase试剂与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料分别作用于不同时期的冷冻基质,结合qPCR和ddPCR进行比较检测,对比其作用效果。结果DNase-qPCR和PMA-qPCR检测3个冷冻阶段活性副溶血性弧菌的Cq值分别为31.41±0.06、32.40±0.04、34.59±0.15和31.24±0.06、32.32±0.03、34.25±0.12, 2种方法Cq值均呈现上升的趋势且数值接近。采用DNase-ddPCR和PMA-ddPCR检测各阶段活性副溶血性弧菌,可直接读出绝对拷贝数,分别为233±6.43、108±5.57、28±3.21和256±6.56、126±3.06、35±2.52。2种方法检测的拷贝数差异不大,重复性好。相对标准偏差均在可接受范围内,符合欧盟定量检测要求。结论DNase处理试剂与PMA对有活性的副溶血性弧菌检测效果相当,与PMA相比,DNase处理法无需强光照射,操作简便快捷,无试剂毒性。ddPCR不需要标准品即能实现对基质中微量活性副溶血弧菌精准定量检测。展开更多
