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重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达 被引量:1
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作者 杨霄鹏 吕同德 +3 位作者 刘斌 王晓辉 唐瑜 贾庆华 《兰州大学学报(医学版)》 CAS 2011年第1期6-10,共5页
目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET-32a(+)/AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET-32a(+)质粒和重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导... 目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET-32a(+)/AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET-32a(+)质粒和重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni^(2+)金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43 kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。 展开更多
关键词 脂联素 大肠埃希菌bl21 表达 诱导 纯化
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重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性 被引量:2
2
作者 李睿 王革 +1 位作者 钱秋娟 王秉翔 《微生物学免疫学进展》 2012年第4期1-5,共5页
目的通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性。方法将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生... 目的通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性。方法将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生化特性、质粒保有率、生长速度等的差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA测序;诱导表达各代次菌株,比较各代次菌株的重组rLF蛋白的表达水平及免疫反应性。结果各代次菌株菌落形态、生化特性、生长速度等方面与原始种子库无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为76%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱未改变,未见lf基因变异;各代次菌株的总蛋白电泳图谱r、LF蛋白表达量r、LF蛋白的免疫反应性与原始种子库无明显差异。结论重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21具有较好的传代稳定性。 展开更多
关键词 重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/bl21 传代稳定性
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基因工程大肠杆菌BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流研究
3
作者 黄聪 李啸 +4 位作者 许超群 张小龙 叶晗 程奔 伍业旭 《中国酿造》 CAS 北大核心 2019年第2期42-46,共5页
该研究基于化学计量平衡建立重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流模型,通过比较模型预测的CO2释放通量值和实验测定的CO_2释放通量值验证该模型的可靠性,分析菌体合成通量和β-甘露聚糖酶合成通量分别最大时的... 该研究基于化学计量平衡建立重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流模型,通过比较模型预测的CO2释放通量值和实验测定的CO_2释放通量值验证该模型的可靠性,分析菌体合成通量和β-甘露聚糖酶合成通量分别最大时的极端代谢流分布,并对代谢网络节点(葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸)进行分析。结果表明,模型预测的CO_2释放通量值和实验测定的CO_2释放通量值无显著差异(P>0.05),模型可靠;通过极端代谢流分析得出,最大菌体合成通量为9.39 h^(-1),最大β-甘露聚糖酶合成通量为0.18 mmol/(g·h);通过代谢网络节点分析得出,葡萄糖-6-磷酸为柔性节点,丙酮酸为刚性节点,为提高β-甘露聚糖酶的生产能力提供理论依据。 展开更多
关键词 基因工程 大肠杆菌bl21 发酵 Β-甘露聚糖酶 代谢流分析
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氨基酸对大肠杆菌BL21生长影响的研究
4
作者 李凤辰 段纪甫 宫衡 《工业微生物》 CAS CSCD 2013年第3期29-31,共3页
研究了14种氨基酸对大肠杆菌BL21生长的影响。研究表明,在以氨基酸为唯一氮源的培养基中,氨基酸对菌体生长的影响可分为三类:(1)能完全被利用的氨基酸:谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸;(2)部分被利用对菌体生长有限制的氨基酸:谷氨酸、丙氨... 研究了14种氨基酸对大肠杆菌BL21生长的影响。研究表明,在以氨基酸为唯一氮源的培养基中,氨基酸对菌体生长的影响可分为三类:(1)能完全被利用的氨基酸:谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸;(2)部分被利用对菌体生长有限制的氨基酸:谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸和亮氨酸;(3)不能被利用的氨基酸:苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸。而在无机氮源存在时,单一氨基酸对大肠杆菌生长的影响可分为两类:(1)能完全被利用的氨基酸:谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸;(2)对生长有一定促进作用的氨基酸:精氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸等。 展开更多
关键词 氨基酸 利用 生长 大肠杆菌bl21
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IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化 被引量:3
5
作者 程太平 荣俊 +3 位作者 刘晓娜 邹浩勇 齐晓亮 樊友净 《动物医学进展》 CSCD 2007年第4期9-13,共5页
采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。在37。C时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025~0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(O.... 采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。在37。C时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025~0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(O.40±0.025~0.65±0.025)进行筛选;在37℃和42℃时诱导,分别对诱导时间(5、6、7、8h)及待选培养基(R1、R2、R3)进行筛选。以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价。结果表明,37℃时诱导,最适宜起始OD600为0.45±0.025,最佳诱导时间为7h,最佳培养基是R1;42℃时诱导,最适宜起始OD600为0.40±0.025,最佳诱导时间为5h,最佳培养基是R2。42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时。因此,以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDVVP2基因,在37℃时诱导表达要比42℃时好。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 PBV220 表达优化 大肠埃希菌bl21
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Efficient and Comprehensive Utilizatio℃n of Hemicellulose in the Corn Stover 被引量:5
6
作者 高鹏飞 范代娣 +4 位作者 骆艳娥 马晓轩 马沛 惠俊峰 朱晨辉 《Chinese Journal of Chemical Engineering》 SCIE EI CAS CSCD 2009年第2期350-354,共5页
Pretreatment of the corn stover powder by dilute sulphuric acid (solid-liquid ratio 1 : 20) at 130 for 30 min was carried out with 89.09% of the hemicellulose removed. After filtration, the xylose-rich corn stover ... Pretreatment of the corn stover powder by dilute sulphuric acid (solid-liquid ratio 1 : 20) at 130 for 30 min was carried out with 89.09% of the hemicellulose removed. After filtration, the xylose-rich corn stover pretreatment liquid, whose fermentable sugar was from hemicellulose hydrolysis only, consisting of 81.16% xylose and 15.27% glucose, was used to cultivate genetic recombinant Escherichia coli BL21 with human-like collagen (HLC) expression enhanced by 50.00% and 63.71% xylose consumption. 展开更多
关键词 corn stover escherichia coli bl21 human-like collagen combined sugar
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利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸 被引量:1
7
作者 范晓光 贾子樊 +5 位作者 李国梁 韩洪军 高立栋 张顺棠 李燕军 陈宁 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期7-12,共6页
尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用... 尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现,来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5'-triphosphate,GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸,而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下,使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶,6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明,以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。 展开更多
关键词 尿苷酸 尿苷-胞苷激酶 嗜热栖热菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌
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重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 被引量:12
8
作者 敬科举 徐志南 +1 位作者 林建平 岑沛霖 《催化学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第11期993-998,共6页
从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有... 从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用. 展开更多
关键词 重组细胞 大肠杆菌 E.coli bl21(pET28-ALR0105)菌株 醛基还原酶 生物催化 4-氯乙酰乙酸乙酯 不对称还原 (R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
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类人胶原蛋白基因工程菌生长期动力学模型
9
作者 骆艳娥 范代娣 迟雷 《化学工程》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第12期46-49,78,共5页
研究类人胶原蛋白基因工程菌生长期动力学模型,为优化发酵调控提供理论依据和指导。应用元素衡算和代谢衡算(EMB)方法,建立类人胶原蛋白基因工程菌生长期的动力学模型,并利用线性规划法对动力学模型参数αh和mX进行估算。结果表明,αh... 研究类人胶原蛋白基因工程菌生长期动力学模型,为优化发酵调控提供理论依据和指导。应用元素衡算和代谢衡算(EMB)方法,建立类人胶原蛋白基因工程菌生长期的动力学模型,并利用线性规划法对动力学模型参数αh和mX进行估算。结果表明,αh和mX分别为1.173 mol/C-mol和2.326 mol/(C-mol.h),该模型能较好地预测重组大肠杆菌生长期的宏观反应速率,且确立了葡萄糖的流加方程。利用EMB方法建立的动力学模型具有重要的应用价值,若要进一步减小氮消耗速率和CO2产生速率预测误差,需要对重组大肠杆菌的代谢网络进行系统分析,建立该模型的修正系数。 展开更多
关键词 元素衡算 代谢衡算 重组大肠杆菌 类人胶原蛋白 动力学模型
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元素衡算和代谢衡算在类人胶原蛋白表达期的应用研究
10
作者 骆艳娥 范代娣 马晓轩 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期45-50,共6页
应用元素衡算和代谢衡算方法,建立用重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白表达期的数学模型,并利用非线性优化法对模型中的未知参数进行估算。结果表明该模型与重组大肠杆菌的生长、代谢动力学模型一致,且模型的关键计算参数αh、αp和mx... 应用元素衡算和代谢衡算方法,建立用重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白表达期的数学模型,并利用非线性优化法对模型中的未知参数进行估算。结果表明该模型与重组大肠杆菌的生长、代谢动力学模型一致,且模型的关键计算参数αh、αp和mx分别为1.173mol.C-mol-1、293.814mol.C-mol-1和17.878mol.C-mol-1.h-1。该模型能较好地预测重组类人胶原蛋白表达期中的宏观反应速率,且在类人胶原蛋白发酵表达期,必须通过控制葡萄糖的补料速率来控制菌体的生长,当μ=0.04h-1时,类人胶原蛋白的比生成速率达最大值。 展开更多
关键词 元素衡算 代谢衡算 重组大肠杆菌 类人胶原蛋白
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重组大肠杆菌表达双功能谷胱甘肽合成酶的发酵工艺研究 被引量:2
11
作者 张松 王德正 +2 位作者 李娓 李志敏 叶勤 《化学与生物工程》 CAS 2013年第8期43-46,共4页
对重组表达双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)的大肠杆菌进行了5L罐的发酵工艺探索,分别考察了不同培养基、诱导剂种类、诱导时机、诱导温度、补料流加碳源类型等对菌体生长、GshF蛋白表达及其酶活的影响。结果表明,采用葡萄糖进行补料流加,... 对重组表达双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)的大肠杆菌进行了5L罐的发酵工艺探索,分别考察了不同培养基、诱导剂种类、诱导时机、诱导温度、补料流加碳源类型等对菌体生长、GshF蛋白表达及其酶活的影响。结果表明,采用葡萄糖进行补料流加,在优化工艺条件下,GshF表达量达到1.94g.L-1。 展开更多
关键词 重组大肠杆菌bl21 双功能谷胱甘肽合成酶 发酵工艺 蛋白表达
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常见电子介体对大肠杆菌微生物燃料电池产电性能的影响 被引量:1
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作者 刘海霞 李雪明 +1 位作者 宋天顺 谢婧婧 《生物加工过程》 CAS 2019年第5期474-480,共7页
采用平板涂布研究电子介体中性红、亚甲基蓝和甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长的抑制情况。通过微生物燃料电池技术(MFC)研究同一浓度下上述电子介体对大肠杆菌BL21(DE3)产电性能的影响。结果表明:甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)的... 采用平板涂布研究电子介体中性红、亚甲基蓝和甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长的抑制情况。通过微生物燃料电池技术(MFC)研究同一浓度下上述电子介体对大肠杆菌BL21(DE3)产电性能的影响。结果表明:甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制最强,中性红对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制作用较弱;添加亚甲基蓝对于大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的提高显著;添加0.06g/L亚甲基蓝对大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的加强效果最好。 展开更多
关键词 微生物燃料电池 大肠杆菌bl21(DE3) 电子介体 中性红 亚甲基蓝 甲基紫精 产电性能
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Site-directed mutagenesis of bifunctional riboflavin kinase/FMN adenylyltransferase via CRISPR/Cas9 to enhance riboflavin production
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作者 Bing Fu Meng Chen +7 位作者 Xianfeng Bao Jiajie Lu Zhiwen Zhu Fuyao Guan Chuyang Yan Peize Wang Linglin Fu Ping Yu 《Synthetic and Systems Biotechnology》 SCIE CSCD 2024年第3期503-512,共10页
Vitamin B_(2)is an essential water-soluble vitamin.For most prokaryotes,a bifunctional enzyme called FAD synthase catalyzes the successive conversion of riboflavin to FMN and FAD.In this study,the plasmid pNEW-AZ cont... Vitamin B_(2)is an essential water-soluble vitamin.For most prokaryotes,a bifunctional enzyme called FAD synthase catalyzes the successive conversion of riboflavin to FMN and FAD.In this study,the plasmid pNEW-AZ containing six key genes for the riboflavin synthesis was transformed into strain R2 with the deleted FMN riboswitch,yielding strain R5.The R5 strain could produce 540.23±5.40 mg/L riboflavin,which was 10.61%higher than the R4 strain containing plasmids pET-AE and pAC-Z harboring six key genes.To further enhance the production of riboflavin,homology matching and molecular docking were performed to identify key amino acid residues of FAD synthase.Nine point mutation sites were identified.By comparing riboflavin kinase activity,mutations of T203D and N210D,which respectively decreased by 29.90%and 89.32%compared to wild-type FAD synthase,were selected for CRISPR/Cas9 gene editing of the genome,generating engineered strains R203 and R210.pNEW-AZ was transformed into R203,generating R6.R6 produced 657.38±47.48 mg/L riboflavin,a 21.69%increase compared to R5.This study contributes to the high production of riboflavin in recombinant E.coli BL21. 展开更多
关键词 Vitamin B_(2) FAD synthase escherichia coli bl21 Riboflavin kinase CRISPR/Cas9
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大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响
14
作者 朱芸 周有治 +1 位作者 储建林 何冰芳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1551-1559,共9页
【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waa F或msb B的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21(DE3)染色体上的基因waa F或msb B敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(Δwaa F)、E... 【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waa F或msb B的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21(DE3)染色体上的基因waa F或msb B敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(Δwaa F)、E.coli BL21(Δmsb B)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒p ET-ffase、p ET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(Δmsb B)/p ET-ffase、E.coli BL21(Δwaa F)/p ET-ffase、E.coli BL21(DE3)/p ET-ffase、E.coli BL21(Δmsb B)/p ET-pga、E.coli BL21(Δwaa F)/p ET-pga、E.coli BL21(DE3)/p ET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株Δmsb B为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株Δwaa F为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株Δwaa F为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株Δmsb B和Δwaa F,Δmsb B能明显增强β-FFase的胞外分泌,而Δwaa F对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(DE3) 膜脂 基因敲除
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大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究 被引量:3
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作者 涂宇鹏 何京桦 +1 位作者 乐科易 严维耀 《复旦学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期796-802,共7页
氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖—磷酸转移酶系统操纵子(m... 氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖—磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GlcN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GlcN的初步特性. 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(DE3) 氨基葡萄糖 λRed同源重组 氨基葡萄糖合成酶 代谢工程
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特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 被引量:1
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作者 晏婷婷 刘展志 +1 位作者 李光耀 吴敬 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4918-4926,共9页
【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高H... 【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高HiC-OMP25在大肠杆菌中的表达量。【方法】分别在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达HiC-OMP25,并测定其对对硝基苯丁酸酯(4-nitrophenol butyrate,p NPB)、聚丙烯酸乙酯(polyethyl acrylate,PEA)的降解效果、50℃稳定性;测定表达HiC-OMP25时宿主菌的细胞膜通透性及细胞表面疏水性变化;共表达伴侣蛋白提高HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量。【结果】HiC-OMP25在E.coli BL21(DE3)与E.coli C43(DE3)中均成功表达并降解pNPB,但前者对PEA的降解效果及50℃稳定性均低于后者。同时,表达HiC-OMP25显著增强了E.coli BL21(DE3)的细胞膜通透性及细胞表面疏水性。HiC-OMP25与巯基氧化酶(Erv1p)、二硫键异构酶(DsbC)在E.coli C43(DE3)中共表达时,其表达量为原始菌株的2.14倍,且对pNPB及PEA均有良好的降解效果。【结论】异源表达时,HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中正确折叠,而在E.coli BL21(DE3)中未完全正确折叠;通过共表达伴侣蛋白提高了HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量,为以后HiC-OMP25的工业化生产及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 HiC-OMP25 escherichia coli bl21(DE3) escherichia coli C43(DE3) 细胞膜通透性 细胞表面疏水性 伴侣蛋白
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来源于不同表达菌株的β-葡聚糖酶酶学性质比较 被引量:2
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作者 汪凌旭 易卓林 +2 位作者 罗惠波 黄丹 赵海 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1312-1317,共6页
β-葡聚糖酶是大曲中重要的水解酶系,在大曲发酵过程中起着水解原料细胞壁和释放胞内淀粉的作用.NFEg16A是首个从浓香型大曲中挖掘到的β-葡聚糖纯酶,其表达系统为大肠杆菌表达系统Escherichia coli BL21.NFEg16A耐热性极好,但酶活却很... β-葡聚糖酶是大曲中重要的水解酶系,在大曲发酵过程中起着水解原料细胞壁和释放胞内淀粉的作用.NFEg16A是首个从浓香型大曲中挖掘到的β-葡聚糖纯酶,其表达系统为大肠杆菌表达系统Escherichia coli BL21.NFEg16A耐热性极好,但酶活却很低.为了提升该酶的酶学性质,成功实现了该酶在Pichia pastoris X33中的异源表达,并将来源于不同表达系统的NFEg16A酶学性质进行对比,从糖基化的角度分析产生这种差异的原因.结果表明,来源于毕赤酵母表达系统的β-葡聚糖酶NFAmy16A-Pichia相较于来源于大肠杆菌表达系统的β-葡聚糖酶NFAmy16A-E. coli,比活提升约40%. NFAmy16A-E. coli最适反应条件为pH 7和70℃;在弱酸性的条件下pH稳定性较好;在50℃时热稳定性最好. NFAmy16A-Pichia最适反应条件为pH 5.5和65℃;在中性条件下pH稳定性最好;且温度耐受范围很广,在30-90℃下热稳定性都很好.对NFAmy16A的糖基化位点进行预测,发现该酶有5个糖基化位点,分别为4个O-糖基化位点(164、168、187、240)和1个N-糖基化(295)位点.本研究表明,可能是因为NFAmy16A在毕赤酵母中发生糖基化反应,从而造成了蛋白质结构的变化从而导致其酶学性质发生改变. 展开更多
关键词 Β-葡聚糖酶 NFEg16A escherichia coli bl21 Pichia pastoris X33 酶学性质 糖基化
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