基因2型鹅星状病毒EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR的建立与应用 被引量：1

1

作者 赵磊 刘廷惠 +3 位作者 杨贝奇 张留君 刘欣超 张训海 《安徽科技学院学报》 2023年第2期25-32,共8页

目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料... 目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料荧光定量一步法RT-PCR检测方法。结果:所建立方法采用dUTP/UDG酶防污染体系,其标准曲线在2.58×10^(1)~2.58×10^(7) copies/μL质粒模板量呈现良好的线性关系,斜率为-3.413,相关系数(R^(2))为0.995,熔解温度T_(M)为(85.5±0.5)℃;该方法对质粒标准品检测灵敏度下限为25.8 copies/μL;该方法特异性检测GoAstV-2,而新城疫病毒(NDV)、H5型禽流感病毒(AIV-H5)、禽呼肠孤病毒(ARV)等11种常见禽传染病病原检测结果均为阴性。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于2%,表明其具有良好的重复性。GoAstV-2感染病死鹅组织定量检测显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、小肠、大脑和肌肉组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏病毒含量最高(2.58×10^(11) copies/g),大脑和肌肉组织含毒量较低。32份临床送检病死鹅组织样品的检测显示,9份存在GoAstV-2感染,阳性率为28.1%。结论:EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR能高效检测GoAstV-2,可应用于禽类GoAstV-2感染的诊断和净化检测。 展开更多

关键词 基因2型鹅星状病毒 荧光定量一步法RT-PCR evagreen

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鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

2

作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 傅光华 施少华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1558-1566,共9页

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工... 鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL^(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL^(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。 展开更多

关键词 鸭肠炎病毒 疫苗株 UL2基因 evagreen 实时荧光定量PCR方法

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EvaGreen染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本

3

作者 朱照辉 林江 +5 位作者 钱军 姚冬明 钱震 王雅丽 韩兰秀 肖高飞 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2009年第5期401-404,共4页

目的：采用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）法检测急性髓系白血病（AML）中黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）基因转录本,初步评价其在AML中的临床意义。方法：设计PRAME基因引物,建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQ-PCR法,对PRAM... 目的：采用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）法检测急性髓系白血病（AML）中黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）基因转录本,初步评价其在AML中的临床意义。方法：设计PRAME基因引物,建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQ-PCR法,对PRAME转录本克隆质粒进行扩增,评价其特异性、重复性和灵敏性。并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测。结果：所建立的EvaGreen RQ-PCR法具有良好的特异性,最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但其重复性差,而10^8～10^2拷贝/μl阳模的重复性良好。10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为4.91×10^2～8.07×10^5拷贝/50ng（中位7.26×10^3拷贝/50ng）,ABL标化后的相对含量为4.42%～13 170.01%（中位67.98%）。而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为0.00%～0.01%（中位0）。1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降,复发时又明显升高。结论：EvaGreen染料法RQ-PCR检测PRAME转录本方法敏感可靠,可用于AML患者临床监测。 展开更多

关键词 实时定量PCR evagreen染料 PRAME基因 急性髓系白血病

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禽偏肺病毒通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：2

4

作者 王贝贝 吴艳阳 +5 位作者 高冬生 刘延珂 万文妍 杨宁霞 王新卫 赵军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期908-912,共5页

为建立各亚型禽偏肺病毒(aMPV)的快速检测方法,本研究对aMPV 4个亚型的核苷酸序列比对分析,针对aMPV N基因的保守区域设计了一对特异性引物,通过条件优化,建立了检测aMPV各亚型的通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在... 为建立各亚型禽偏肺病毒(aMPV)的快速检测方法,本研究对aMPV 4个亚型的核苷酸序列比对分析,针对aMPV N基因的保守区域设计了一对特异性引物,通过条件优化,建立了检测aMPV各亚型的通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在模板为10~3拷贝/μL～10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;检测下限为10~3拷贝/μL,敏感性为常规RT-PCR的10倍。与其它常见禽类病毒无交叉反应;组内重复试验和组间重复试验的变异系数分别为0.89%～1.34%和2.01%～3.29%,具有较好的重复性。利用所建立的方法对河南省部分地区鸡场送检病鸡样品进行检测,结果显示被检地区鸡场的aMPV的平均阳性率为46.66%,与普通RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的EvaGreen荧光定量RT-PCR方法可以用于aMPV的检测,为aMPV感染的流行病学调查提供了可行方法。 展开更多

关键词 禽偏肺病毒 通用型 evagreen RT-PCR

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EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立 被引量：2

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作者 容新宗 杨春 +4 位作者 郑朝共 刘波 袁源 苗松 何太平 《中国输血杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1173-1175,共3页

目的建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台。方法根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物。对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片... 目的建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台。方法根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物。对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料。结果应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好。结论以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间。 展开更多

关键词 evagreen 猪细小病毒 血液制品 病毒 去除 实时荧光定量PCR

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EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

6

作者 蔡晔 饶品彬 +1 位作者 吴海港 姜永厚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期75-80,共6页

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,... 根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 evagreen 实时荧光定量PCR 检测

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EvaGreen实时荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒方法的建立

7

作者 朱超 郭巍 +4 位作者 胡哲 赵钊 刘彦辰 王晓钧 曲娟娟 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第9期29-32,共4页

为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N... 为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N7亚型EIV、马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马疱疹病毒均无特异性反应;最低检测限度能达到10拷贝/μL;并且该方法具有良好的重复性。说明Eva Green这种新型荧光染料可以敏感有效地检测EIV,可用于马流感的诊断。 展开更多

关键词 H3N8亚型马流感病毒 evagreen实时荧光定量PCR 方法 建立

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EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)方法的建立和应用

8

作者 郑晓文 饶品彬 +2 位作者 蔡晔 杨宗歧 姜永厚 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第9期123-126,共4页

目前,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为全球范围内影响较广的猪类重要疾病之一,因此建立快速、有效的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术成为预防和控制PRRS传播的关键。在序列分析的基础上,设计特异性引物,建立基于熔解曲线分析的Ev... 目前,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为全球范围内影响较广的猪类重要疾病之一,因此建立快速、有效的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术成为预防和控制PRRS传播的关键。在序列分析的基础上,设计特异性引物,建立基于熔解曲线分析的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法。该方法能够特异性扩增PRRSV,并用经熔解曲线分析产生特异性的熔解峰,而非靶标病毒未产生非特异性扩增;PRRSV的检测灵敏度可达50 copies/μL;批内、批间重复试验中变异系数均在2%以内;对118份临床样品进行检测,阳性率为31.4%,与普通PCR检测结果相符率为100%。结果表明,建立的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法具有较高的特异性、灵敏度和良好的重复性,可用于临床PRRSV感染的早期诊断及分子流行病学调查。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) evagreen实时荧光定量PCR 熔解曲线分析 检测

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犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

9

作者 董杰 刘若寒 +1 位作者 李守军 周沛 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期699-705,共7页

建立了犬圆环病毒(canine circovirus,CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCVRep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各... 建立了犬圆环病毒(canine circovirus,CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCVRep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R2值为0.9995;该方法检测灵敏度为3.88×10^(1) copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为CanineCV感染的病原学检测工具。 展开更多

关键词 犬圆环病毒 evagreen 实时荧光定量PCR

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三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量PCR应用中的比较 被引量：15

10

作者 邵晓青 吕申 +1 位作者 冯璐 李梅 《大连医科大学学报》 CAS 2016年第5期428-431,共4页

目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线... 目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。 展开更多

关键词 定量PCR SYBR GreenⅠ LC Green PLUS evagreen

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鹅多瘤病毒VP1基因的克隆及EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：1

11

作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 陈翠腾 黄瑜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期2289-2295,共7页

针对鹅多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)VP1基因核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从1株樱桃谷鸭源GHPV(命名为FJ201601株)扩增获得VP1基因核苷酸序列全长,并进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其VP1基因分子特... 针对鹅多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)VP1基因核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从1株樱桃谷鸭源GHPV(命名为FJ201601株)扩增获得VP1基因核苷酸序列全长,并进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其VP1基因分子特征。基于GHPV各分离株VP1基因特点,设计特异性的实时荧光定量PCR引物,建立基于EvaGreen实时荧光定量PCR检测GHPV方法。结果显示,克隆的FJ201601株VP1基因全长为1 062bp,与GHPV各参考分离株核苷酸同源性为99.7%~100.0%;在遗传进化上可将GHPV分为2个大的遗传进化分支(Clade 1和Clade 2),FJ201601株属于Clade 2分支。建立的EvaGreen检测GHPV实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线方程y轴截距为39.12,斜率为-3.489,扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.7%;敏感性强,最低检测限为88.0拷贝/μL;特异性好,扩增产物的溶解曲线分析只出现单一的特异峰,Tm值为(82.18±0.22)℃,无引物二聚体,对水禽常见病原检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%~1.76%和0.92%~2.44%。用建立的检测方法对80份多品种生长不良鸭进行检测发现4份阳性(樱桃谷鸭2份、麻鸭2份),阳性率为5%(4/80)。本研究证实麻鸭中存在GHPV感染,为丰富GHPV感染宿主谱和开展GHPV感染流行病学调查和致病机理研究提供检测手段。 展开更多

关键词 鹅多瘤病毒 VP1基因 evagreen实时荧光定量PCR方法 樱桃谷鸭 麻鸭

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EvaGreen实时定量PCR检测急性髓系白血病GRAF基因表达 被引量：1

12

作者 钱震 林江 +5 位作者 钱军 姚冬明 王雅丽 韩兰秀 朱照辉 肖高飞 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期290-293,共4页

目的 研究急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子（GTPase regulator associated with the focal adhesion kinase,GRAF）基因的表达及其临床意义.方法 建立EvaGreen染料法实时定量聚合... 目的 研究急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子（GTPase regulator associated with the focal adhesion kinase,GRAF）基因的表达及其临床意义.方法 建立EvaGreen染料法实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）,对71例AML患者和21例良性血液病患者中GRAF转录本水平进行检测,分析其临床相关性.结果 所建立的EvaGreen RQ-PCR方法具有良好的特异性、重复性,敏感度达102拷贝/μL.AML患者中GRAF转录本水平（0.01%～169.75%,中位3.82%）较对照组（14.49%～126.85%,中位56.04%）显著降低（P〈0.05）,GRAF基因表达量与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、FAB亚型、染色体核型分组均无相关性（P〉0.05）.结论 AML患者中GRAF基因表达下调,可能与其发病有关. 展开更多

关键词 粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子 急性髓系白血病 evagreen染料 实时定量聚合酶链反应

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EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒 被引量：3

13

作者 王琪 黄翩翩 +5 位作者 贾晓芸 徐金花 方海荣 周小坚 苏影 莫秋华 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2018年第4期229-232,共4页

目的建立能同时检测甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)和鼻病毒(HRV)的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法。方法针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5’NCR设计检测引物,并使3个基因扩增产物的解链温度(T_m值)相差... 目的建立能同时检测甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)和鼻病毒(HRV)的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法。方法针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5’NCR设计检测引物,并使3个基因扩增产物的解链温度(T_m值)相差≥1.5℃。采用Eva Green新型荧光染料,通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系。通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验,对新建方法进行性能验证。结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰,T_m值范围分别为:Flu-A,85.0~85.5℃;Flu-B,82.5~83.0℃;HRV,88.5~89.5℃,可以通过T_m值差异明显区分3种病毒。100份临床样本的性能验证显示,新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能。结论针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法。该方法简便实用、成本低廉,为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础。 展开更多

关键词 evagreen染料 多重荧光RT-PCR 熔解曲线 呼吸道病毒

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LCGreen Plus与EvaGreen在HRM法检测EGFR基因变异中的比较 被引量：1

14

作者 孙雪睿 王玉 +1 位作者 高佳林 李梅 《大连医科大学学报》 CAS 2020年第5期391-394,共4页

目的探讨饱和荧光染料LCGreen Plus与EvaGreen在HRM法基因变异检测中的差异。方法选取34例课题组保存的DNA标本(EGFR第18-21外显子突变情况已知),以双盲法分别应用LCGreen Plus与EvaGreen染料HRM法在Rotor-Gene Q平台进行上述片段基因... 目的探讨饱和荧光染料LCGreen Plus与EvaGreen在HRM法基因变异检测中的差异。方法选取34例课题组保存的DNA标本(EGFR第18-21外显子突变情况已知),以双盲法分别应用LCGreen Plus与EvaGreen染料HRM法在Rotor-Gene Q平台进行上述片段基因变异检测,由两位拥有HRM分析基础的人员进行结果判定,比较两种染料基因检测的准确率并分析熔解曲线特征。结果LCGreen Plus和EvaGreen检测上述4个基因片段的准确率、灵敏性和特异性分别为100%(136/136)和90.4%(123/136)、100%(69/69)和81.1%(56/69)、100%(67/67)和100%(67/67)。LCGreen Plus和EvaGreen标记的熔解曲线特征不同。结论了解饱和双链DNA染料标记的熔解曲线特征,选用合适判读方法可能有助于减少假阴性结果的产生。 展开更多

关键词 LCGreen Plus evagreen 高分辨熔解曲线

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牛血清中牛腺病毒3型EvaGreen qPCR检测方法的建立 被引量：1

15

作者 贺倩 鱼轲 +5 位作者 郭敏 李永佳 司璐 刘军 李佳林 魏至栋 《微生物学免疫学进展》 CAS 2022年第4期15-20,共6页

目的建立EvaGreen qPCR检测牛腺病毒3型(bovine adenovirus 3,BAV3)的方法,用于牛血清等牛源材料的检测。方法依据GenBank公布的BAV3标准毒株WBR-1全基因序列,基于E2B区域高度保守序列设计引物,提取并制备DNA标准品,建立EvaGreen qPCR检... 目的建立EvaGreen qPCR检测牛腺病毒3型(bovine adenovirus 3,BAV3)的方法,用于牛血清等牛源材料的检测。方法依据GenBank公布的BAV3标准毒株WBR-1全基因序列,基于E2B区域高度保守序列设计引物,提取并制备DNA标准品,建立EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,并对该方法的特异性、灵敏度及精密度进行验证。最后利用该方法检测牛血清中的BAV3,并与细胞培养法及荧光抗体检测对比,以验证该方法的适用性。结果建立的EvaGreen qPCR检测BAV3的方法标准曲线R^(2)>0.99,扩增效率处于90%~110%,可检测范围为0.2×10^(0)~0.2×10copies/μL。实验内Ct值的CV<2.2%,在不同实验间Ct值的CV<1.8%。设计的BAV3引物与牛腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、副流感病毒3型(parainfluenza virus 3,PI3)、呼肠孤病毒(reovirus,REO)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、狂犬病毒(rabies virus,RV)、羊轮状病毒(Lanzhou lamb rotavirus,LLR)基因组均无交叉反应,特异性良好。采用EvaGreen qPCR对198份新生牛血清进行BAV3检测,阳性检出率为10.1%,检出率高于细胞培养法及荧光抗体检测。结论成功建立了EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,该方法快速、灵敏、特异、易于标准化,可用于牛血清中BAV3的检测。 展开更多

关键词 外源病毒 牛腺病毒3型 实时定量PCR evagreen

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无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性 被引量：1

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作者 郜莉娜 尤崇革 +2 位作者 潘云燕 李光迪 王芳芳 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第16期1484-1487,共4页

目的:探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性(SNP)的实用性.方法:采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型.以其-597G>A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物... 目的:探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性(SNP)的实用性.方法:采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型.以其-597G>A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg2+浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化.并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证.结果:结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg2+浓度为2.5mmol/L,不对称PCR引物比例为0.1/0.5μmol/L,模板浓度为10ng/10μL的两步法不对称PCR.该体系对100例样本进行IL-6基因-597G>A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致.结论:无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法. 展开更多

关键词 白细胞介素6 evagreen 无标记探针 多态性 单核苷酸

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PCR-HRM技术在华法林最佳用药剂量关联基因单核苷酸多态性检测中的应用 被引量：1

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作者 王芳芳 尤崇革 +3 位作者 李光迪 潘云燕 郜莉娜 李菲菲 《现代检验医学杂志》 CAS 2011年第2期32-34,共3页

目的 最新研究显示华法林最佳用药剂量关联基因CYP2C9,CYP4F2和VKORC1可指导临床个体化用药,该成果的临床应用有赖于临床快速分子诊断方法的建立,为此该论文建立PCR-HRM（High-resolution melting）技术检测华法林最佳用药剂量关联基因... 目的 最新研究显示华法林最佳用药剂量关联基因CYP2C9,CYP4F2和VKORC1可指导临床个体化用药,该成果的临床应用有赖于临床快速分子诊断方法的建立,为此该论文建立PCR-HRM（High-resolution melting）技术检测华法林最佳用药剂量关联基因单核苷酸多态性（SNP）并进行应用评价.方法 采用国际最前沿的基因突变筛查技术-HRM和新型荧光染料Eva Green对华法林最佳用药剂量关联基因CYP2C9＊2,CYP2C9＊3,CYP4F2 V433M和VKORC1 1173C/T四个SNP位点先进行染料法荧光PCR,接着进行PCR产物的高分辨熔解,依据熔解峰的特点进行SNP分型即PCR-HRM技术建立,最后通过检测临床181例标本进行临床应用评价.结果 在181例服用华法林的患者中检测到CYP2C9＊2杂合子2例,CYP2C9＊3杂合子15例,CYP4F2 V433M杂合子74例,纯合子14例,VKORC1 1173C/T杂合子33例.随机选择各类基因型PCR产物共24例进行测序,验证结果与检测结果一致.结论 PCR-HRM技术检测华法林最佳用药剂量关联基因SNP是一种灵敏、简便、快捷的低成本检测方法,可用于临床常规化分子诊断. 展开更多

关键词 华法林 evagreen 高分辨熔解技术 单核苷酸多态性

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使用Eva Green染料的荧光PCR定性检测转基因产品 被引量：1

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作者 高宏伟 梁成珠 +1 位作者 岳志芹 吴华 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2006年第3期319-324,共6页

本文把一种新型荧光染料——Eva Green应用在荧光PCR中,通过设计特异性的引物来检测转基因产品。所检测的转基因基因包括内对照基因rbcl,外源基因的筛选基因Carny 35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ基因,外源基因的鉴定转基因大豆roundupready... 本文把一种新型荧光染料——Eva Green应用在荧光PCR中,通过设计特异性的引物来检测转基因产品。所检测的转基因基因包括内对照基因rbcl,外源基因的筛选基因Carny 35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ基因,外源基因的鉴定转基因大豆roundupready的CP4CP4EPSPS和转基因马铃薯NEWLEAF的PVYcp。实验结果表明,各对引物特异性强,使用EvaGreen荧光检测的结果稳定,检测线可以小于0．5％． 展开更多

关键词 荧光PCR 转基因 evagreen 马铃薯

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自制实时定量PCR试剂在基因扩增中的效果评价 被引量：1

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作者 姬丽娟 李倩 +1 位作者 李汉超 郝志明 《当代化工研究》 2021年第6期149-150,共2页

实验目的:评价自制实时定量PCR试剂在基因扩增效率上与商品化的差异,同时优化试剂配方,保证其稳定性。实验方法:1.原核表达纯化Taq DNA聚合酶,PCR确定纯化Taq DNA聚合酶的活性及在实时定量PCR中的使用浓度。2.自制实时定量PCR试剂,加入... 实验目的:评价自制实时定量PCR试剂在基因扩增效率上与商品化的差异,同时优化试剂配方,保证其稳定性。实验方法:1.原核表达纯化Taq DNA聚合酶,PCR确定纯化Taq DNA聚合酶的活性及在实时定量PCR中的使用浓度。2.自制实时定量PCR试剂,加入适当浓度的EvaGreen,以pAAV-LacZ质粒为模板,CMV为引物,进行实时定量聚合酶链反应,根据Ct值的变化,琼脂糖凝胶电泳,扩增曲线,溶解曲线来评估反应的灵敏度及特异性。3.调整自制的Real-time PCR mix中甘油,BSA等的浓度,在保证实时定量PCR结果准确性的情况下,尽可能的保证Taq DNA聚合酶的活性。 展开更多

关键词 Taq DNA聚合酶 实时定量PCR mix evagreen

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添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR检测体系的建立与评价 被引量：16

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作者 但现龙 刘斌 +4 位作者 李小玲 张利达 施春雷 周敏 史贤明 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1119-1127,共9页

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引... 【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。 展开更多

关键词 沙门氏菌 靶点筛选 evagreen荧光定量PCR 扩增内标

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