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FUS1和IL-12双基因真核共表达质粒的构建及对A549细胞促凋亡作用研究 被引量：2
1
作者 张冬梅 杨寒朔 +3 位作者 朱文 冯志华 邓洪新 魏于全 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期569-574,共6页
目的构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用。方法采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因。FUS... 目的构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用。方法采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因。FUS1和IL-12分别经酶切后定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点中,酶切和测序鉴定双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12的构建。以pVITRO2-FUS1-IL-12转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR、ELISA和Western blot方法检测目的基因的表达,以Hoechst33258染色及流式细胞术验证pVITRO2-FUS1-IL-12在体外的促凋亡作用。结果酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12,在转染后的细胞中同时检测到了FUS1和IL-12的表达,两种基因在双基因表达载体上的表达量基本不受影响。双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12具有明显诱导肺癌细胞凋亡的作用。结论成功构建pVITRO2-FUS1-IL-12双基因真核共表达质粒,为肺癌的多基因联合治疗提供了又一新的思路和方法。 展开更多
关键词 肺癌 fus1 IL-12 真核共表达载体 联合基因治疗
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hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定 被引量：2
2
作者 张艳丽 张文卿 +3 位作者 王秋波 丁守怡 吕锐 董海 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期987-991,共5页
目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之... 目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。 展开更多
关键词 hil-12 HER2/NEU ECD pIMP1 生孢梭菌
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FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物特性研究
3
作者 余川江 肖雯婧 +3 位作者 张冬梅 欧文婧 冯志华 朱文 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第4期859-864,共6页
研究FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物的生物学和药剂学特性,评估其作为肺癌基因治疗药物的转染效率、稳定性以及毒性。阳离子脂质体与质粒以不同质量比配制后用凝胶阻滞实验和激光粒度仪测定粒径和zeta电位确定阳离子脂质体与质粒... 研究FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物的生物学和药剂学特性,评估其作为肺癌基因治疗药物的转染效率、稳定性以及毒性。阳离子脂质体与质粒以不同质量比配制后用凝胶阻滞实验和激光粒度仪测定粒径和zeta电位确定阳离子脂质体与质粒DNA的最佳配比;通过分别转染增强型绿色荧光蛋白质粒EGFP和PVITO2-hIL12/FUS1双基因质粒入A549肺癌细胞,倒置荧光显微镜、细胞爬片免疫组化和酶联免疫法分别检测EGFP、FUS1和hIL-12在肺癌细胞中的表达;以琼脂糖凝胶电泳检测双基因脂质体复合物与血清和DNaseⅠ孵育的稳定性;通过双基因脂质体复合物与红细胞孵育后显微镜观察其对红细胞形态的影响。研究结果为将来FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物用于肺癌的基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 fus1/hil-12 真核共表达质粒 阳离子脂质体 肺癌 基因治疗
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