G418抗性HEK293细胞的培育 被引量：6

1

作者 吕茂民 贾莉玮 +3 位作者 王建国 杨姝 熊景峰 章金刚 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第1期5-6,共2页

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行... 目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。 展开更多

关键词 g418抗性 HEK293细胞 培育 猪内源性反转录病毒 细胞模型 抗性细胞

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G418抗性筛选标记在板栗疫病菌中的应用 被引量：8

2

作者 蓝秀万 陈敏玫 +3 位作者 桂磊 范云燕 甘文剑 陈保善 《广西农业生物科学》 CSCD 2007年第B06期7-11,共5页

板栗疫病菌-低毒病毒系统,是一个优良的研究植物病原真菌致病和病毒-宿主相互作用分子机制的模型。随着研究的深入,原有的苯菌灵和潮霉素两个遗传转化筛选标记已不能满足研究需要。文章报道构建一个由构巢曲霉trpC启动子驱动的G418抗性... 板栗疫病菌-低毒病毒系统,是一个优良的研究植物病原真菌致病和病毒-宿主相互作用分子机制的模型。随着研究的深入,原有的苯菌灵和潮霉素两个遗传转化筛选标记已不能满足研究需要。文章报道构建一个由构巢曲霉trpC启动子驱动的G418抗性Neo基因盒,并成功应用于板栗疫病菌的遗传转化研究。 展开更多

关键词 板栗疫病菌 g418抗性 遗传转化

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以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究 被引量：2

3

作者 唐俊 马越 +3 位作者 王姝妹 徐孟竹 刘生杰 陈捷 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第12期185-189,共5页

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,... 【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。 展开更多

关键词 g418抗性 根癌农杆菌 深绿木霉

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G418抗性基因nptⅡ双元载体的构建及谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化 被引量：5

4

作者 曹旸 刘永翔 +2 位作者 谭玉梅 王海 刘作易 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期2509-2513,共5页

为给谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)多基因功能的研究提供新的选择标记,利用MYA培养基测G418敏感性后,以质粒pcDNA3.1(+)为中间载体构建nptⅡ基因表达元件,利用根癌农杆菌介导法转化至谢瓦氏曲霉间型变种... 为给谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)多基因功能的研究提供新的选择标记,利用MYA培养基测G418敏感性后,以质粒pcDNA3.1(+)为中间载体构建nptⅡ基因表达元件,利用根癌农杆菌介导法转化至谢瓦氏曲霉间型变种。结果表明:用构巢曲霉PgpdA启动子、nptⅡ基因和构巢曲霉色氨酸C终止子TtrpC组成的G418抗性基因盒替换双元载体pDHt/sk-bar上的草丁膦抗性盒,成功构建双元载体pDHt/sknt,并且通过根癌农杆菌介导的转化获得的G418抗性转化子遗传稳定,nptⅡ基因主要以单拷贝形式插入谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA中。因此,双元载体pDHt/sknt适用于谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化。 展开更多

关键词 g418抗性 双元载体 谢瓦氏曲霉间型变种 遗传转化

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以G418抗性为选择标记的金龟子绿僵菌原生质体转化的研究 被引量：2

5

作者 王晓玲 蒋伶活 张泽华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第28期8865-8866,8868,共3页

[目的]提高绿僵菌的生防效果。[方法]利用PEG方法,将含有G418抗性标记的质粒pSM334转化绿僵菌原生质体,并在高于绿僵菌敏感的G418浓度下筛选转化子。[结果]转化率达15~23个/μg质粒。将转化子在非选择压力下连续培养5代,其抗性稳定不变... [目的]提高绿僵菌的生防效果。[方法]利用PEG方法,将含有G418抗性标记的质粒pSM334转化绿僵菌原生质体,并在高于绿僵菌敏感的G418浓度下筛选转化子。[结果]转化率达15~23个/μg质粒。将转化子在非选择压力下连续培养5代,其抗性稳定不变。稳定性试验表明,所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。[结论]该研究为提高绿僵菌的生防效果提供了依据。 展开更多

关键词 绿僵菌 g418抗性 原生质体 转化

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一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

6

作者 赵思捷 朱文琦 +7 位作者 孙杰 侯俊 王友亮 李永利 李波 鲍春梅 张浩 李伯安 《生物技术通讯》 CAS 2019年第4期528-532,共5页

目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx)mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒... 目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx)mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。 展开更多

关键词 g418抗性 慢病毒载体 RNA干扰 乙型肝炎病毒X基因

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G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备 被引量：8

7

作者 周江 杨晓 +2 位作者 孙彦旬 吕雅歆 黄翠芬 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2001年第1期59-61,共3页

目的 :制备G4 18抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法 :利用一个neo基因成功整合到基因组的小鼠品系Smad3ex8+/ ,从其妊娠 14d的雌鼠中获取胚胎 ,先制备小鼠胚胎成纤维细胞 ,PCR鉴定基因型后 ,挑选一株neo基因杂合型的小鼠胚胎成纤维细... 目的 :制备G4 18抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法 :利用一个neo基因成功整合到基因组的小鼠品系Smad3ex8+/ ,从其妊娠 14d的雌鼠中获取胚胎 ,先制备小鼠胚胎成纤维细胞 ,PCR鉴定基因型后 ,挑选一株neo基因杂合型的小鼠胚胎成纤维细胞 ,用丝裂霉素C处理即获得G4 18抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。结果 :利用此方法制备的滋养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长 ,在含G4 18的筛选培养基中能存活 1～ 展开更多

关键词 胚胎干细胞 滋养层 制备 g418抗性 小鼠

原文传递

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立 被引量：7

8

作者 万英 张大军 +1 位作者 黄云 蒋伶活 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第29期12602-12604,共3页

[目的]建立极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体，并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及... [目的]建立极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体，并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3-4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代，G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 极细链格孢菌 g418抗性 原生质体 转化

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黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的抗性转化

9

作者 田聆 张义正 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第S1期179-186,共8页

作者描述了黄孢原毛平革菌抗性转化的经过和结果 .在测定黄孢原毛平革菌对G4 18和潮霉素的敏感性的基础上 ,将在实验室已经分离到的由黄孢原毛平革菌基因启动子所构建成的融合卡那霉素抗性基因质粒切为线状 ,用原生质体转化法将其转化... 作者描述了黄孢原毛平革菌抗性转化的经过和结果 .在测定黄孢原毛平革菌对G4 18和潮霉素的敏感性的基础上 ,将在实验室已经分离到的由黄孢原毛平革菌基因启动子所构建成的融合卡那霉素抗性基因质粒切为线状 ,用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌 ,用浓度为 2 0 0 μg/mL的G4 18成功地筛选到 16个G4 18r 转化子 .在测定了这些G4 18r 转化子的抗性水平和稳定性的基础上 ,用PCR扩增G4 18r 转化子中融合卡那霉素抗性基因启动子片段和Southern杂交两种方法 ,对G4 18r 转化子进行分析和鉴定 .结果表明 :融合卡那霉素抗性基因以单个或串状重复的形式整合入黄孢原毛平革菌基因组中 .G4 18r 转化子的确定不仅可为建立黄孢原毛平革菌的转化系统提供选择标记基因 ,而且证明所分离的基因启动子在黄孢原毛平革菌中的功能 ,同时还证明了以Escherichiacoli为宿主菌 ,直接用基因启动子探针型载体分离真核生物的基因启动子是完全可行的 .实验结果还表明 ,由异源基因启动子构建的融合潮霉素抗性基因质粒 pAN7 1和 pCSN4 3不能转化黄孢原毛平革菌 . 展开更多

关键词 黄孢原毛平革菌 融合Kan^r基因 g418抗性 转化

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巴马小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立 被引量：1

10

作者 黄红梅 吕茂民 +5 位作者 陈忠伟 王娜 赵武 陈凤莲 吴健敏 章金刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期312-315,365,共5页

首先将巴马小型猪(BM)、巴马香猪(BMXZ)外周血淋巴细胞分别与G418抗性HEK293细胞(G418R293)共培养,通过G418加压筛选,除去共培养体系中巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞,然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴... 首先将巴马小型猪(BM)、巴马香猪(BMXZ)外周血淋巴细胞分别与G418抗性HEK293细胞(G418R293)共培养,通过G418加压筛选,除去共培养体系中巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞,然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果经6周共培养及3周加压筛选后,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化;PCR及RT-PCR鉴定表明,筛选后的共培养体系中已没有巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞的存在;PERV特异性检测方法检测显示,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。从而证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系,为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台。 展开更多

关键词 g418抗性 HEK293细胞 猪内源性反转录病毒

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表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

11

作者 陈怡 叶秋萍 +2 位作者 刘鑫 宫君原 李淑琴 《岭南现代临床外科》 2011年第4期270-273,共4页

目的建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法... 目的建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果经600 μg / mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。 展开更多

关键词 肾细胞癌 g250 HgM-CSF g418抗性 HEK293细胞

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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选 被引量：1

12

作者 杨湘越 武圣明 +1 位作者 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期695-696,共2页

关键词 Annexin32 酵母分泌型表达载体 构建 高拷贝转化子 快速筛选 毕赤酵母 g418抗性筛选

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法夫酵母整合型表达载体的构建

13

作者 陈丽娜 朱艳冰 +1 位作者 倪辉 李利君 《集美大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第3期185-191,共7页

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子... 为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验. 展开更多

关键词 法夫酵母 整合载体 构建 g418抗性

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WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

14

作者 段君君 方峰 +3 位作者 张小玉 王江 贾霄 何颖红 《昆明医科大学学报》 CAS 2017年第6期1-4,共4页

目的构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体,建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因,将WDR5插入pCI-neo载体中,酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞,Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表... 目的构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体,建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因,将WDR5插入pCI-neo载体中,酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞,Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后,用G418筛选获得稳定表达的细胞株,Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达,为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础. 展开更多

关键词 WDR5 真核表达 g418抗性 脂质体转染

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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

15

作者 王广兰 宫璀璀 +3 位作者 刘亚利 初霞 王文丽 李璇 《实用医药杂志》 2009年第11期61-63,66,共4页

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1... 目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。 展开更多

关键词 可溶性1型补体受体1 毕赤酵母细胞 g418抗性筛选 分泌型表达载体

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膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗抗肿瘤治疗作用研究 被引量：4

16

作者 黄常新 余海 +4 位作者 杨关根 王青青 沈芬平 李达 曹雪涛 《中华胃肠外科杂志》 CAS 2005年第3期255-258,共4页

目的研制膜表达热休克蛋白(HSP)70瘤苗并研究其抗肿瘤治疗作用。方法以膜表达HSP70的真核表达载体pDisplay-mbHSP70转染肠癌细胞株CT26。用G418抗性筛选获得阳性克隆,扩增并制备瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应;在B... 目的研制膜表达热休克蛋白(HSP)70瘤苗并研究其抗肿瘤治疗作用。方法以膜表达HSP70的真核表达载体pDisplay-mbHSP70转染肠癌细胞株CT26。用G418抗性筛选获得阳性克隆,扩增并制备瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应;在BALB/c小鼠结直肠癌模型中观察瘤苗的抗肿瘤治疗作用;并检测实验鼠的自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明,大量HSP70表达并结合在肠癌瘤苗细胞膜表面。比较对照,胞浆表达HSP70瘤苗显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应,较强的瘤体生长抑制,并使荷瘤鼠的生存时间延长;而膜表达HSP70瘤苗比胞浆表达者有着更高的淋巴增殖刺激效应,更强的瘤体生长抑制作用,并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长。结论HSP70表达并结合在细胞膜表面的肠癌细胞瘤苗对结直肠癌CT26荷瘤小鼠有更强的治疗作用。 展开更多

关键词 热休克蛋白70 膜表达 抗肿瘤治疗 作用研究 HSP70表达 细胞毒性T淋巴细胞 g418抗性筛选 BALB/c小鼠 激光共聚焦显微镜 治疗作用 真核表达载体 刺激效应 自然杀伤细胞 淋巴细胞增殖 生长抑制作用 结直肠癌 胞膜表面 脾淋巴细胞

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碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵 被引量：7

17

作者 望潇文 向腊 +2 位作者 徐婷 卢争辉 张桂敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2017-2027,共11页

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已... 碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。 展开更多

关键词 碱性果胶酶 毕赤酵母 g418抗性标记 组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记 高密度发酵

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毕赤酵母己糖运载体HXT1基因缺失菌株的构建 被引量：2

18

作者 张文文 张平 +2 位作者 宣姚吉 周祥山 张元兴 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1340-1344,共5页

葡萄糖在酵母胞内的转运是依靠己糖运载体家族成员完成的。目前在酿酒酵母中已鉴定了18个己糖运载体基因,各自功能也已得到深入的研究。然而在作为优良蛋白表达系统的毕赤酵母中,目前国内外尚未有此类基因的相关报道。本文基于酵母同源... 葡萄糖在酵母胞内的转运是依靠己糖运载体家族成员完成的。目前在酿酒酵母中已鉴定了18个己糖运载体基因,各自功能也已得到深入的研究。然而在作为优良蛋白表达系统的毕赤酵母中,目前国内外尚未有此类基因的相关报道。本文基于酵母同源重组率高的特性,以G418作为抗性筛选标记,分别在其5′和3′端连接待缺失毕赤酵母基因HXT1开放阅读框ORF的上下游各200bp作为同源重组区,电转毕赤酵母GS115感受态,通过不同浓度G418抗性平板筛选,最终得到了HXT1基因缺失的毕赤酵母菌株GS115ΔHXT1。通过与野生株比较发现,HXT1基因缺失株的生长状况及葡萄糖利用都有所下降。 展开更多

关键词 毕赤酵母 己糖运载体 g418抗性 基因缺失

原文传递

来自ATCC的基因靶向工具

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《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期388-388,共1页

ATCC发布三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-104... ATCC发布三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-1049TM）是一个克隆,来自于具有G418抗性和鼠类LIF高表达的STO细胞系。SNLP 76/7-4（SCRC-1050TM）是一株带有嘌呤霉素抗性的克隆,来自于SNL 76/7。要了解更多信息,请访问www.atcc.org/MEF6。 展开更多

关键词 ATCC 耐药基因 胚胎干细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞 g418抗性 工具 靶向 嘌呤霉素

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来自ATCC的基因靶向工具

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《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第6期572-572,共1页

ATCC发布三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-104... ATCC发布三个新的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4MEF（ATCC誖SCRC-1045TM）带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素（G418）、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7（SCRC-1049TM）是一个克隆,来自于具有G418抗性和鼠类LIF高表达的STO细胞系。 展开更多

关键词 ATCC 耐药基因 胚胎干细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞 工具 靶向 g418抗性 嘌呤霉素

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