文摘目的基于网络药理学及生物信息学探讨葛根芩连方治疗非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的作用机制。方法首先从GEO数据库中下载NAFLD的GSE89632和GSE63067的微阵列数据集,通过数据清洗后及以识别健康个体和NASH患者样本之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其次在GeneCards数据库中下载NAFLD蛋白质编码的表型基因。利用TCMSP数据库和相关文献筛选葛根芩连方主要活性成分及靶点,通过Uniprot蛋白平台匹配靶点对应的靶基因,然后将数据库数据集及GeneCards差异表达基因与葛根芩连方有效活性成分靶点进行交集,绘制韦恩图,上传至STRING平台,进行蛋白质互作分析(protein-protein interaction,PPI),通过Cytoscape不同算法挖掘核心基因,并通过Cytoscape 3.9.1软件构建核心基因蛋白互作网络及“葛根芩连方—活性成分—交集靶点基因”网络图;并对交集靶点基因进行免疫浸润、免疫细胞差异分析及核心基因免疫细胞差异性分析。利用R软件对靶点进行基因功能(gene ontology,GO)富集与通路(kyoto encydopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。并通过TargetScan数据库预测调控核心基因的上游miRNA,利用AutoDock软件进行小分子药物配体与miRNA受体的分子对接,利用Pymol进行可视化处理。结果GEO等数据库筛选差异表达基因8467个,葛根芩连方有效活性成分146个,药物活性成分靶点基因与数据库差异表达基因交集47个,核心基因10个,趋化因子-2(chemokines-2,CCL2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等10个基因被鉴定为NAFLD有前途的诊断生物标志物。GO富集分析涉及对氧化应激、脂质代谢、泛素蛋白连接酶结合、细胞坏死及凋亡、miRNA转录调控等的反应,KEGG富集分析在磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路、非酒精性脂肪性肝病、核因子激活的B细胞的K-轻链增强子通路、肿瘤抑制因子信号通路。药物与疾病靶点交集基因免疫浸润分析得到活化树突状细胞,自然杀伤T细胞,自然杀伤细胞,滤泡辅助性T细胞(follicularhelper T cell,Tfh),辅助性T细胞2(T help 2 cell,Th2),细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,CD8+T)是浸润NAFLD的主要免疫细胞,免疫细胞差异分析及核心基因免疫相关性分析,得到Tfh细胞、树突状细胞与Th2等与RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、信号转导与转录激活因子等核心基因的相关性较高。通过分子对接方法验证汉黄芩素、山柰酚、槲皮素等8个药物有效成分与调控核心基因的miRNA分子对接结合能力强。结论研究确定了10个核心基因及miRNA作为诊断NAFLD的潜在生物标志物。通过分子对接验证,提示药物小分子与miRNA结合能力强,因此miRNA可能是影响NAFLD发展的潜在调控途径。葛根芩连方药物有效活性成分通过调控miRNA影响核心靶点的转录为治疗NAFLD的分子机制提供新线索。同时免疫细胞Tfh细胞、树突状细胞与Th2等可能与核心基因协同影响NAFLD疾病的进程。
