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可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白的构建表达及功能鉴定
1
作者 吴珍珍 翁秀芳 吴雄文 《齐齐哈尔医学院学报》 2013年第24期3596-3598,共3页
目的构建HLA-B54/IgG1真核表达载体,稳定转染至721.221细胞中,获得HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白。方法通过RT-RCR我们获得了HLA-B54的胞外段与人IgG1的CH1-CH2-CH3的cDNA,将HLA-B54与IgG1重链的恒定区插入到质粒pcDNA3.1(+)中形成pcDNA... 目的构建HLA-B54/IgG1真核表达载体,稳定转染至721.221细胞中,获得HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白。方法通过RT-RCR我们获得了HLA-B54的胞外段与人IgG1的CH1-CH2-CH3的cDNA,将HLA-B54与IgG1重链的恒定区插入到质粒pcDNA3.1(+)中形成pcDNA3.1(+)-HLA-B54/IgG1Fc重组基因。为了获得稳定转染,用电穿孔法将质粒pcDNA3.1(+)-HLA-B54/IgG1Fc转染到721.221细胞中,大量收集通过G418筛选的721.221阳性克隆株的无血清的上清,通过PEG20000浓缩得到可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白,双抗体夹心ELISA和Western-blot(利用MHCⅠ类特异性抗体、人IgG的Fc段特异性抗体)来鉴定融合蛋白。结果限制性内切酶酶切鉴定及序列测定等证实了成功构建了pcDNA3.1+[HLA-B54/IgG1Fc]重组质粒。ELISA和Western-blot结果表明:HLA-B54/IgG1Fc融合基因能够在721.221细胞中表达。融合蛋白由预期的HLA-B54的胞外段与IgG1的Fc段两个部分组成。结论二聚体融合蛋白HLA-B54/IgG1的构建有助于理解HLA-B54限制性的T细胞反应。 展开更多
关键词 HLA-B54 igg1融合蛋白 真核表达 构象完整
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共价连接β2m的HLA-A2/IgG1二聚体的构建、表达与纯化
2
作者 郝娟 段红霞 +4 位作者 李庆 孙伟 钟茂华 翁秀芳 吴雄文 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期1-5,共5页
目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/I... 目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率。结果β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.221细胞后可表达正确构象的β2 m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍。结论共价连接β2 m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整。 展开更多
关键词 β2m-HLA—A2/igg1融合蛋白 真核表达 亲合层析 构象完整
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体外阻断CD134对LN患者外周血单个核细胞T_H1/T_H2细胞因子表达的影响 被引量：1
3
作者 周燕斌 李幼姬 +1 位作者 谢灿茂 吴玉红 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期923-927,共5页
目的探讨CD134/CD134L共刺激分子对TH1/TH2细胞因子表达的影响及在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的可能作用。方法活动期LN患者10例,分别采取外周静脉血,用密度梯度离心法制备新鲜PBMC,分成6组:(1)对照培养组;(2)单纯刺激组;(3)抗CD134组;(4... 目的探讨CD134/CD134L共刺激分子对TH1/TH2细胞因子表达的影响及在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的可能作用。方法活动期LN患者10例,分别采取外周静脉血,用密度梯度离心法制备新鲜PBMC,分成6组:(1)对照培养组;(2)单纯刺激组;(3)抗CD134组;(4)抗IL-4组;(5)rh-CD134∶Fc组;(6)地塞米松(Dex)组。另选取10例健康体检者作为健康对照组。采用ELISA法分别测定培养液上清中IFN-γ、IL-4、IL-10表达水平。结果(1)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激前,活动期LN患者PBMC培养液上清分泌的IFN-γ、IL-4和IL210水平都明显高于健康对照组;(2)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激下,活动期LN患者PBMC分泌的IFN2γ、IL-4和IL-10又较刺激前明显增加;(3)抗IL-4单抗、抗CD134单抗均可使经抗CD3ε单抗PrIL22刺激的LN患者PBMC分泌IL24、IL210水平显著下降,导致IFN2γ水平显著增高,免疫应答朝TH1方向偏离;(4)Dex能显著抑制抗CD3ε单抗PrIL22刺激的原代培养PBMC中IL24、IFN2γ的分泌水平,但对IL210的产生并没有明显的抑制或促进作用;(5)rhCD134∶Fc能显著降低抗CD3ε单抗PrIL-2刺激的原代培养PBMC中IFN-γ及IL-4、IL-10的分泌水平,对TH1和TH2细胞因子的产生都有显著抑制作用。结论糖皮质激素的抗炎机制具有多重性,对TH1、TH2细胞因子的作用并不均衡;抗CD134单抗对减轻LN患者PBMC的异常活化有一定作用;CD134-IgG融合蛋白与抗CD134单抗相比,抑制作用更明显,对急性期LN有更好的治疗作用。 展开更多
关键词 狼疮性肾炎(LN) CD134(OX40) CD134L(OX40L) 抗CD134单抗 重组人cD134igg1(rhCD134-igg1)融合蛋白 细胞因子
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