MBP-CsgAⅢ融合蛋白的表达和纯化 被引量：2

1

作者 冷静 郑禹 +2 位作者 曾霞 王启辉 卞钊 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期390-392,共3页

目的构建CsgA亚单位蛋白的原核表达系统,获得纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定基础。方法用PCR的方法从大肠杆菌野生株MC4100株中扩增出csgA基因,连接到pMALp2质粒上,构建pZBaⅢ重组质粒。将重组质... 目的构建CsgA亚单位蛋白的原核表达系统,获得纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定基础。方法用PCR的方法从大肠杆菌野生株MC4100株中扩增出csgA基因,连接到pMALp2质粒上,构建pZBaⅢ重组质粒。将重组质粒转入XL1Blue菌中用IPTG诱导表达,用AmyloseResin纯化系统纯化。结果成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,获得大量纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白。结论成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,应用该系统能有效表达MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定了基础。 展开更多

关键词 Curli菌毛 CsgA mbp-csgaⅲ融合蛋白 克隆表达

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西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备以及应用分析 被引量：1

2

作者 李林海 陈丽丹 +2 位作者 廖杨 陈建芸 石玉玲 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期742-745,共4页

目的制备针对西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体,并分析其在临床检测中的应用价值。方法采用原核表达系统表达西尼罗河病毒preM/E融合蛋白,作为抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合... 目的制备针对西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体,并分析其在临床检测中的应用价值。方法采用原核表达系统表达西尼罗河病毒preM/E融合蛋白,作为抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用有限稀释法筛选能稳定分泌抗preM/EⅢ单抗的杂交瘤细胞株。接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔,抽取腹水纯化单克隆抗体。采用间接ELISA和Western blotting对抗体特异性和效价进行分析,并对临床样本进行检测。结果获得了1株能稳定分泌preM/EⅢ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为ME1。纯化后抗体效价为10-6,其亚类为IgG1。ME1单抗能与西尼罗病毒preM/EⅢ蛋白以及西尼罗病毒发生特异性反应,而与日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)无交叉反应。临床诊断准确率为97.78%。结论 ME1单克隆抗体具有较高的特异性,临床诊断准确性较高,具有临床应用价值。 展开更多

关键词 西尼罗河病毒 preM/Eⅲ融合蛋白 单克隆抗体 特异性

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TAT-CAⅢ融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能鉴定

3

作者 尚西亮 陈世益 +3 位作者 任惠民 李云霞 陈疾忤 华英汇 《中国运动医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期534-538,共5页

目的:构建含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定TAT-CAⅢ的跨膜转运功能。方法:采用PCR的方法扩增编码CAⅢ和TAT-CAⅢ全长的DNA序列,分别重组入pET28a质粒表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(D... 目的:构建含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定TAT-CAⅢ的跨膜转运功能。方法:采用PCR的方法扩增编码CAⅢ和TAT-CAⅢ全长的DNA序列,分别重组入pET28a质粒表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),构建重组体的表达菌株;IPTG诱导表达后,用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化融合蛋白,纯化产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及磷酸酶活性染色;然后分别以1μmol/L纯化的CAⅢ及TAT-CAⅢ孵育C2C12成肌细胞1h,间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况。结果及结论:成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体;转化大肠埃希菌BL21(DE3)后表达并纯化出相对分子量分别约32 000(CAⅢ)和35 000(TAT-CAⅢ)的融合蛋白,Westernblot和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白;间接免疫荧光染色显示,TAT-CAⅢ孵育组细胞内可见有较强的绿色荧光,而CAⅢ组细胞内则未见荧光,表明TAT可介导CAⅢ由胞外跨膜转导进入胞内。 展开更多

关键词 碳酸酐酶ⅲ 融合蛋白 纯化 蛋白质转导域

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MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建 被引量：4

4

作者 苏楠 吴敬君 +3 位作者 李晔 张翀 李梅 邢新会 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第7期2829-2842,共14页

肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法... 肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。 展开更多

关键词 麦芽糖结合蛋白 肝素酶ⅲ 融合蛋白 序列优化 大肠杆菌

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肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达 被引量：5

5

作者 刘艳青 毛旭虎 +2 位作者 王庆旭 易勇 邹全明 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期106-109,共4页

目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC3... 目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502)。融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 肠血性大肠杆菌(EHEC)O157 : H7 ⅲ型分泌蛋白EspA 紧密粘附素 C-端免疫保护性片断(IntiminC300) 融合蛋白 疫苗

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重组糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂的表达和纯化

6

作者 查艳萍 秦永文 +1 位作者 荆清 穆瑞斌 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第6期535-539,共5页

观察糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂重组GST KGDX(谷胱甘肽S 转移酶 赖 甘 天冬 X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用。设计合成了两条编码KGDX(赖 甘 天冬 X)的寡核苷酸链 ,两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。将该基因插入原核高效表达载体p... 观察糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂重组GST KGDX(谷胱甘肽S 转移酶 赖 甘 天冬 X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用。设计合成了两条编码KGDX(赖 甘 天冬 X)的寡核苷酸链 ,两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。将该基因插入原核高效表达载体pGEX 4T 1的tac启动子下游 ,获得重组质粒 pGEX 4T 1KGDX ,转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达。GST KGDX融合蛋白具有可溶性 ,产量为 35mg/L培养基 ,表达量占菌体总蛋白的 48.0 2 %。破碎菌体上清经谷胱甘肽 琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯度为 95 %的重组蛋白。血小板凝聚仪检测活性表明 ,在体外GST KGDX融合蛋白抑制ADP诱导的人血小板聚集作用强于GST(P <0 .0 5或 <0 .0 1 )。全血流式细胞术结果表明 ,GST KGDX能与GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合。结论 :大肠杆菌中能够表达出较高产量的GST KGDX融合蛋白 。 展开更多

关键词 重组糖蛋白Ⅱb/ⅲa 受体拮抗剂 表达 纯化 GST-KGDX融合蛋白 抗血小板作用

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谷胱甘肽S-转移酶-KGDX融合蛋白的抗血小板作用 被引量：1

7

作者 查艳萍 秦永文 +1 位作者 荆清 穆瑞斌 《现代临床医学生物工程学杂志》 2001年第4期244-247,252,共5页

目的　观察重组GST -KGDX(谷胱甘肽S -转移酶 -赖 -甘 -天冬 -X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用 .方法　设计合成了两条编码KGDX(赖 -甘 -天冬 -X)的寡核苷酸链 ,长度为 36个碱基对 ,两端分别为BamHI酶和XcoI酶切位点 .将该基因插入原... 目的　观察重组GST -KGDX(谷胱甘肽S -转移酶 -赖 -甘 -天冬 -X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用 .方法　设计合成了两条编码KGDX(赖 -甘 -天冬 -X)的寡核苷酸链 ,长度为 36个碱基对 ,两端分别为BamHI酶和XcoI酶切位点 .将该基因插入原核高效表达载体PGEX - 4T - 1的tac启动子下游 ,获得重组质粒PGEX - 4T -1KGDX ,转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达 .采用谷胱甘肽 -琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯化蛋白 .用血小板凝聚仪检测活性 .结果　GST -KGDX融合蛋白具有可溶性 ,产量为 35mg/升培养基 ,表达量占菌体总蛋白 48.0 2 % ,容易从裂解菌中纯化得到 .体外实验 :GST、GST -KGDX融合蛋白均能抑制ADP诱导的人血小板聚集 ,GST -KGDX强于GST(p<0 .0 5或 <0 .0 1) ,其IC50 值分别为 4μmol/L、6 μmol/L .结论　 (1)GST、GST -KGDX融合蛋白在体外均能抑制ADP诱导的人血小板聚集 .(2 )大肠杆菌中能够表达出较高产量的GST -KGDX融合蛋白 ,为抗血小板因子提供了一个很好的蛋白质来源 . 展开更多

关键词 基因重组 蛇毒 大肠杆菌 KPⅡb/ⅲa拮抗剂 GST-KGDX融合蛋白 抗血小板作用

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抗大肠杆菌curli菌毛CsgA蛋白特异性抗体的制备及鉴定 被引量：3

8

作者 冷静 曾霞 +2 位作者 郑禹 王启辉 卞钊 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期370-372,共3页

目的为进一步研究curli菌毛主要蛋白CsgA的功能,利用MBP-CsgA融合蛋白免疫兔子制备抗体。方法用PCR方法扩增大肠杆菌MHC4100株的csgA基因,在大肠杆菌中表达MBP-CsgA融合蛋白,免疫家兔以制备抗血清,用Westernblotting和免疫电镜鉴定抗MBP... 目的为进一步研究curli菌毛主要蛋白CsgA的功能,利用MBP-CsgA融合蛋白免疫兔子制备抗体。方法用PCR方法扩增大肠杆菌MHC4100株的csgA基因,在大肠杆菌中表达MBP-CsgA融合蛋白,免疫家兔以制备抗血清,用Westernblotting和免疫电镜鉴定抗MBP-CsgA融合蛋白抗体的特异性。结果PCR扩增出约476 bp的csgA基因,在大肠杆菌XL1-Blue中成功地表达了Mr约为58 000的MBP-CsgAⅢ融合蛋白,Western blotting和免疫电镜检测证明,针对MBP-CsgA融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别MBP-CsgA,也可识别源于大肠杆菌的csgA蛋白,抗血清的最高滴度达1∶50 000。结论亚克隆csgA基因,成功表达MBP-CsgA融合蛋白,制备并获得其特异性抗curli菌毛抗体。 展开更多

关键词 csgA mbp-csgaⅲ融合蛋白 多克隆抗体

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人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定 被引量：1

9

作者 张兴梅 石玉生 刘忠英 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期151-153,共3页

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的... 目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。 展开更多

关键词 表皮生长因子受体 ⅲ型突变体 胞外区 原核表达 融合蛋白

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加味蠲痹汤对腰椎后路减压融合内固定术后椎旁肌损伤模型SD大鼠影响实验研究 被引量：1

10

作者 杨亚龙 吴勐 +2 位作者 魏媛媛 陈启华 史双彬 《四川中医》 2020年第8期52-56,共5页

目的:探究加味蠲痹汤对腰椎后路减压融合内固定术后椎旁肌损伤模型SD大鼠疗效及碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)mRNA、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)的作用。方法:大鼠均模拟临... 目的:探究加味蠲痹汤对腰椎后路减压融合内固定术后椎旁肌损伤模型SD大鼠疗效及碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)mRNA、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)的作用。方法:大鼠均模拟临床腰椎后路减压融合内固定术模式建立椎旁肌损伤模型。将15只建模成功的SD大鼠随机分为3组(n=5),即模型组、低剂量组和高剂量组,另取5只健康大鼠作为对照组。低剂量组和高剂量组的大鼠分别按照9.1g/Kg、18.2g/Kg体重标准使用加味蠲痹汤灌胃。干预5d后椎旁肌损伤评分和苏木素-伊红(HE)染色分析损伤恢复情况。检测和比较血清中组胺和肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)水平。使用qPCR和Western blot检测软组织中bFGF mRNA、Collagen-Ⅰ/Ⅲ蛋白的水平。结果:低剂量组和高剂量组大鼠椎旁肌损伤评分低于模型组(P<0.05),并且高剂量组的椎旁肌损伤评分低于低剂量组(P<0.05)。HE染色结果显示对照组的软组织结构正常;模型组细胞排列紊乱、纤维断裂和炎性浸润,同时出现纤维增生;低剂量组和高剂量组的椎旁肌损伤程度均显著轻于模型组,并且高剂量组的软组织基本恢复。模型组大鼠血清组胺和TNF-α的水平明显升高(P<0.05),与模型组比较,低剂量组和高剂量组的水平显著降低(P<0.05),其中高剂量组大鼠血清组胺和TNF-α的水平显著低于低剂量组(P<0.05)。模型组大鼠软组织中bFGF mRNA、Collagen-Ⅰ/Ⅲ蛋白水平明显升高(P<0.05),与模型组比较,低剂量组和高剂量组bFGF mRNA显著升高而Collagen-Ⅰ/Ⅲ蛋白的水平显著降低(P<0.05),其中高剂量组大鼠软组织中bFGF mRNA显著高于低剂量组,而Collagen-Ⅰ/Ⅲ蛋白水平显著低于低剂量组(P<0.05)。结论:加味蠲痹汤可有效的促进腰椎后路减压融合内固定术后椎旁肌损伤大鼠的组织恢复,降低大鼠炎症反应,增加bFGF mRNA蛋白表达,降低Collagen-Ⅰ/Ⅲ蛋白表达。 展开更多

关键词 腰椎后路减压融合内固定术后椎旁肌损伤 加味蠲痹汤 碱性成纤维细胞生长因子 Ⅰ型胶原蛋白 ⅲ型胶原蛋白

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基因工程

11

《生物技术通报》 CAS CSCD 1990年第12期27-39,共13页

903189 采用核酸外切酶Ⅲ纯化真核染色体外环状DNA[英]/Gaubatz,J.w.…∥Anal Biochem.-1990,184(2).-305～310[译自 DBA,1990,9(8),90-04215]采用核酸外切酶Ⅲ对线性及开环DNA 进行预备性消化.

关键词 核酸外切酶ⅲ 多克隆位点 DNA 限制酶 密度梯度离心 启动子 融合蛋白 BamHI 氯化铯 RNA

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Atacicept有望治疗类风湿关节炎

12

《中国医院用药评价与分析》 2008年第3期219-219,共1页

关键词 类风湿关节炎 治疗 重组融合蛋白 ⅲ期临床试验 细胞发育 关节炎患者 关节炎症状 阿姆斯特丹

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乙型脑炎病毒DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型上的免疫效应评价 被引量：1

13

作者 于瑞明 田占成 +3 位作者 高闪电 独军政 关贵全 殷宏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期2902-2911,共10页

为了评价基因Ⅰ型乙型脑炎病毒prM-E DNA疫苗与prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗采用DNA初免-蛋白加强免疫策略对小鼠的免疫效果,本研究将prM-E融合基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建重组表达载体prM-E-pVAX1作为DNA疫苗进行初免,利用原核... 为了评价基因Ⅰ型乙型脑炎病毒prM-E DNA疫苗与prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗采用DNA初免-蛋白加强免疫策略对小鼠的免疫效果,本研究将prM-E融合基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建重组表达载体prM-E-pVAX1作为DNA疫苗进行初免,利用原核表达系统获得的prM和EⅢ融合抗原作为亚单位疫苗进行加强免疫。将32只4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成4组,设置prM-E-pVAX1 DNA疫苗组、DNA初免-蛋白加强免疫组、prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗组及pVAX1载体对照组,通过ELISA检测血清中特异性抗体水平;通过噬斑减少中和试验滴定中和抗体滴度;通过细胞因子表达丰度和淋巴细胞增殖试验分析不同疫苗免疫组诱导产生的细胞免疫反应。结果表明,用DNA初免-蛋白加强策略免疫的小鼠诱导产生的中和抗体滴度略高于prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗免疫组,显著高于prM-E-pVAX1 DNA疫苗免疫组。DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型中诱导产生了有效的Th1/Th2型免疫反应,特别是显著诱导了Th1型细胞免疫反应。本研究为预防流行性乙型脑炎提供了新的免疫策略和理论参考依据。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎 DNA疫苗 prM和Eⅲ融合抗原 DNA初免-蛋白加强

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