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MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响 被引量：1
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作者 谢思豪 勾红潮 +4 位作者 卞志标 李斌 蔡汝健 臧莹安 李春玲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1934-1941,共8页
【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利... 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。 展开更多
关键词 mlkl基因 CRISPR/Cas9基因编辑技术 敲除 PK-15细胞 猪伪狂犬病病毒(PRV)
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