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人Notch受体胞内区基因N2ICD和N3ICD克隆及真核表达体系的构建 被引量：2
1
作者 孙芳 李玉霞 +7 位作者 毛艳 凌焱 张小男 李伟东 刘刚 梁龙 陈珊 陈惠鹏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期108-113,共6页
Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建... Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。 展开更多
关键词 NOTCH信号通路 n2icd/pEGFP N3ICD/pEGFP 真核表达
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人Notch受体胞内区基因N2ICD克隆及真核表达 被引量：1
2
作者 陈中标 叶健斌 +4 位作者 梁来妹 杨宜 宁立军 宁云山 李妍 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期310-314,共5页
目的构建真核重组质粒N2ICD/p CMV-Tag4并转染HEK 293T细胞进行表达。方法根据GenBank上Notch2的NICD序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人宫颈癌细胞Hela细胞扩增人Notch2受体胞内区基因(N2ICD),酶切和测序鉴定后克... 目的构建真核重组质粒N2ICD/p CMV-Tag4并转染HEK 293T细胞进行表达。方法根据GenBank上Notch2的NICD序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人宫颈癌细胞Hela细胞扩增人Notch2受体胞内区基因(N2ICD),酶切和测序鉴定后克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4并进行瞬时和稳定转染HEK 293T细胞,荧光定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹(WB)检测目的蛋白的表达。结果通过RT-PCR克隆获得人N2ICD基因并成功构建重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4,目的蛋白N2ICD在HEK 293T细胞中获得表达。结论成功构建稳定表达N2ICD的HEK 293T细胞株,为进一步探讨Notch2受体的功能奠定基础。 展开更多
关键词 Notch2信号通路 n2icd 真核表达 pCMV-Tag4
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人Notch2受体胞内区基因N2ICD的原核表达、纯化和鉴定
3
作者 陈中标 李飞 +6 位作者 李佩婷 邱晓媚 叶健斌 胡冰心 宁立军 宁云山 李妍 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期335-340,共6页
[目的]构建含Notch2胞内区基因N2ICD的原核重组质粒,并在E.coli中表达。[方法]根据Gen Bank上N2ICD基因序列设计引物,用PCR从真核重组质粒p CMV-Tag4/N2ICD中扩增目的基因,克隆至携带GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中并转化E.coli BL2... [目的]构建含Notch2胞内区基因N2ICD的原核重组质粒,并在E.coli中表达。[方法]根据Gen Bank上N2ICD基因序列设计引物,用PCR从真核重组质粒p CMV-Tag4/N2ICD中扩增目的基因,克隆至携带GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中并转化E.coli BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌体经反复冻融、溶菌酶破菌、超声破碎后,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达形式,表达产物经谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose 4B纯化并经Western Blot鉴定。[结果]PCR获取了目的基因人N2ICD,并成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1/N2ICD,目的基因在E.coli中成功表达并以部分可溶性形式表达在上清中,纯化后经Western Blot鉴定表达产物分子量在110 k Da。[结论]重组N2ICD在E.coli中成功获得可溶性表达,为研究Notch2受体在细胞信号转导中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 NOTCH2 n2icd 克隆 原核表达 纯化 鉴定
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慢病毒介导N2ICD过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株的构建及鉴定
4
作者 吴丹琳 温俊杰 +9 位作者 叶健斌 薛杨 林彦青 胡冰心 罗美群 陈中标 谢金玲 宁立军 宁云山 李妍 《生物技术》 CAS 2018年第4期372-376,共5页
[目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三... [目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,收集且浓缩病毒毒液用于感染人胃癌MKN45细胞并筛选稳定细胞株,用Western Blot验证。[结果]成功构建慢病毒重组质粒N2ICD/pLV;包装病毒后,荧光显微镜下观察到大部分HEK293T细胞发出绿色荧光;收集病毒毒液感染MKN45细胞,显微镜下观察有部分细胞表达绿色荧光蛋白;流式分选技术筛选得到稳定细胞株,Western Blot鉴定结果显示:相比于空白对照组,稳定株的N2ICD过表达明显。[结论]成功构建慢病毒表达质粒N2ICD/pLV,并建立稳定过表达N2ICD的胃癌细胞株N2ICD/pLV-MKN45。 展开更多
关键词 NOTCH2 n2icd 慢病毒 稳定株
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