PTD-hEGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及活性分析 被引量：2

1

作者 智庆文 王淑豪 +2 位作者 张凤英 李仕贵 孙曼霁 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期589-592,共4页

为获得hEGF在大肠杆菌中的高效表达,构建了pPTD-hEGF原核表达载体。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG诱导,PTD-hEGF融合蛋白进行了有效表达,表达产物主要形成了包涵体。经Ni2+-NTA亲和层析纯化,融合蛋白的纯度达99.5%。MALDI-... 为获得hEGF在大肠杆菌中的高效表达,构建了pPTD-hEGF原核表达载体。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG诱导,PTD-hEGF融合蛋白进行了有效表达,表达产物主要形成了包涵体。经Ni2+-NTA亲和层析纯化,融合蛋白的纯度达99.5%。MALDI-TOF-MS分析证明表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。PTD-hEGF融合蛋白能明显促进HEK-293细胞的分裂和生长。 展开更多

关键词 ptd—hegf融合蛋白 原核表达 HEK-293细胞

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PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究 被引量：6

2

作者 黄莉莉 邵启祥 +8 位作者 张慧 许逊 宗杨勇 陈述 申卫红 田小雷 彭鑫 王胜军 许化溪 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2007年第3期188-192,196,共6页

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃... 目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用。结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力。结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 ptd Foxp3融合蛋白 免疫抑制

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PTD-HBcAg融合蛋白经树突状细胞诱导特异性CTL抑制HBV的体外研究 被引量：4

3

作者 陈小华 潘庆春 +2 位作者 余永胜 汤正好 臧国庆 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期289-292,共4页

目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对HBV的抑制作用。方法:体外分离培养小鼠髓源性DC,加入融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10... 目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对HBV的抑制作用。方法:体外分离培养小鼠髓源性DC,加入融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的分泌水平,流式细胞术检测胞内细胞因子水平,乳酸脱氢酶释放试验检测特异性CTL活性,并对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平进行检测。结果:经不同融合蛋白刺激的DCs能有效促进T淋巴细胞的细胞因子分泌,同时融合蛋白PTD-HBcAg组中IL-2(552.7±117.5ng/L)和INF-γ(150.6±7.945ng/L)明显高于HBcAg组中IL-2(420±12.47ng/L)和INF-γ(107.5±12.19ng/L)分泌。流式细胞计数术检测的PTD-HBcAg融合蛋白诱导CTL细胞水平明显高于对照组。经PTD-HBcAg融合蛋白诱导的CTL比HBcAg有明显的特异性杀伤作用(P<0.05),同时对HBsAg及HBV DNA水平有明显的抑制作用。结论:经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的DCs能有效刺激T淋巴细胞分泌细胞因子及增加细胞毒T淋巴细胞的表达,并增强特异性CTL活性及对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。 展开更多

关键词 ptd—HBcAg 融合蛋白 T淋巴细胞 细胞因子 特异性CTL

原文传递

PTD-GFP融合蛋白的纯化及其转导效率测定 被引量：4

4

作者 徐艳玲 岳玉环 +6 位作者 张国利 吴广谋 田园 张培培 付玉和 赵鑫 侯天全 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第1期25-28,257,共5页

为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融... 为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融合蛋白,将纯化的蛋白加入到体外培养的He La细胞中,在荧光显微镜下观察PTD-GFP的转导情况,用InfiniteF500多功能酶标仪检测荧光强度,分析融合蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:纯化的重组蛋白纯度达到90%。原浓度蛋白和1/2原蛋白浓度24 h后转导效率都达到100%。通过统计学软件得到转导效率与PTD-GFP融合蛋白浓度之间的线性关系,回归系数为0.151 456,相关系数为0.954。说明融合蛋白纯度较高,其转导效率对蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着浓度增加转导效率增加。 展开更多

关键词 蛋白转导域(ptd) 绿色荧光蛋白(GFP) 融合蛋白 纯化 转导效率

原文传递

hEGF和hbFGF的C端(78-154aa)融合蛋白的表达、纯化及活性测定 被引量：3

5

作者 余榕捷 张玲 +4 位作者 林剑 谢秋玲 孙奋勇 蒲含林 李志英 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期367-370,共4页

目的 :将人表皮生长因子 (hEGF)与人碱性成纤维细胞生长因子 (hbFGF)的C端连接 ,构建出既可与肝素结合 ,又具有促进细胞生长活性的融合蛋白 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :将PCR扩增hEGF全基因与PCR扩增hbFGF 5 端的 2 31bp的片段连... 目的 :将人表皮生长因子 (hEGF)与人碱性成纤维细胞生长因子 (hbFGF)的C端连接 ,构建出既可与肝素结合 ,又具有促进细胞生长活性的融合蛋白 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :将PCR扩增hEGF全基因与PCR扩增hbFGF 5 端的 2 31bp的片段连接 ,克隆到表达载体pJN ,构建出含融合基因的表达质粒pJRH。将pJRH转化BL2 1(DE3)表达菌株 ,获得融合蛋白的表达菌株pJRH(BL)。Westernblot检测表达产物免疫学活性。表达产物上肝素亲和柱和分子筛进行纯化。结果 :融合蛋白表达产量为 30 % ,融合蛋白不仅能与肝素结合 ,而且具有促细胞增殖的活性。Westernblot检测结果显示融合蛋白有EGF的免疫活性。融合蛋白的等电点为 5 2。结论 :本研究构建了一个hEGF和hbFGF的C端的融合蛋白 ,该蛋白基本保持了两者原有的生物活性。作为一个新的活性因子 ,本研究为探讨活性因子蛋白结构与功能的关系奠定基础。 展开更多

关键词 表皮生长因子 尿抑胃素 成纤维细胞生长因子 碱性 重组融合蛋白类 大肠杆菌 hegf

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TAT-hEGF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效自我表达 被引量：1

6

作者 智庆文 苗爱玲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期89-91,100,共4页

为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌... 为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的45.6%,主要以包涵体形式存在。 展开更多

关键词 TAT—hegf融合蛋白 人表皮生长因子 包涵体 E.COLI BL21(DE3)

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PHLD融合蛋白在毕赤酵母中的构建和表达

7

作者 张新国 郭广君 +4 位作者 李坤 孙巧云 郭思佳 马小弟 马国艳 《生命科学研究》 CAS CSCD 2018年第6期475-482,共8页

δ-睡眠肽(delta sleep inducing peptide, DSIP)的相对分子质量较小,在体内半衰期较短,因此本研究将蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、连接肽(linker)以及δ-睡眠肽(DSIP... δ-睡眠肽(delta sleep inducing peptide, DSIP)的相对分子质量较小,在体内半衰期较短,因此本研究将蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、连接肽(linker)以及δ-睡眠肽(DSIP)进行融合表达,以获得重组PHLD睡眠肽融合蛋白。研究以pPIC9K/HSA为模板,利用PCR技术进行扩增,将获得的PHLD基因连接到表达载体pPIC9K上,然后转入组氨酸缺陷型毕赤酵母GS115,经G418筛选获得了高表达PHLD融合蛋白的酵母工程菌株,并进一步获得了高纯度的融合蛋白。本研究将为DSIP的深入研究和应用提供技术资料。 展开更多

关键词 δ-睡眠肽(DSIP) 人血清白蛋白(HSA) 连接肽 蛋白质转导结构域(ptd) 毕赤酵母 融合蛋白

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hCu,Zn-SOD-TAT PTD的融合表达及其跨膜转运性质的初步研究 被引量：5

8

作者 汪飞鹏 桂向东 宋礼华 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第1期11-15,共5页

HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPT... HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPTD编码序列的 3’引物PCR扩增得hCu ,Zn SOD TATPTD融合基因 ,并插入 pUC19。将SOD基因和SOD TATPTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体 pJW 2 ,转化大肠杆菌DH5α。SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,热击诱导 4h后 ,分别在 19ku和 2 2ku处出现SOD和SOD TATPTD目标表达条带 ,表达蛋白以包含体形式存在。分别提取SOD和SOD TATPTD包含体 ,复性纯化后SOD和SOD PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性 ,其比活性分别为 12× 10 3 NU/mg和 9.9× 10 3 NU/mg。细胞试验结果表明 ,与SOD相比较 ,SOD TATPTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力。 展开更多

关键词 SOD-TAT ptd融合蛋白 原核表达 蛋白转导

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重组hEGF基因的原核表达及活性分析

9

作者 智庆文 王淑豪 +2 位作者 付爱玲 孙曼霁 李仕贵 《中国药理通讯》 2003年第3期62-63,共2页

关键词 重组hegf基因 原核表达 表皮生长因子 生物学活性 融合蛋白 胃溃疡

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细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

10

作者 李风 柯博文 +1 位作者 孙中伟 韩双艳 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2021年第11期151-158,260,共9页

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因(epEGF)的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组大肠杆菌株BL21(DE3)/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初... 该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因(epEGF)的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组大肠杆菌株BL21(DE3)/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子(hEGF)在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。 展开更多

关键词 人表皮生长因子(hegf) 细胞穿膜肽(CPPs) 融合表达 蛋白分离纯化

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BALB/c小鼠宫颈癌原位瘤模型的建立与治疗 被引量：1

11

作者 刘晓雯 王娇 +1 位作者 袁萍 孙军 《巴楚医学》 2018年第2期1-5,共5页

目的:通过建立BALB/c小鼠原位瘤模型,模拟临床肿瘤环境,为观察PTD4-apoptin融合蛋白的抗肿瘤效应提供实验基础。方法:采用两种方法建立BALB/c小鼠宫颈癌原位瘤模型,以PTD4-apoptin融合蛋白进行21天的短期治疗。TUNEL检测PTD4-apoptin融... 目的:通过建立BALB/c小鼠原位瘤模型,模拟临床肿瘤环境,为观察PTD4-apoptin融合蛋白的抗肿瘤效应提供实验基础。方法:采用两种方法建立BALB/c小鼠宫颈癌原位瘤模型,以PTD4-apoptin融合蛋白进行21天的短期治疗。TUNEL检测PTD4-apoptin融合蛋白的促凋亡效应,HE染色评估肿瘤的形态学变化。结果:与异体异位宫颈癌组织移植法相比,宫颈注射U14宫颈癌细胞悬液的成瘤效果更好。原位瘤给予PTD4-apoptin融合蛋白可显著抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞的凋亡。结论:小鼠宫颈注射U14宫颈癌细胞悬液可建立宫颈癌原位瘤模型,PTD4-apoptin融合蛋白可抑制该原位癌。 展开更多

关键词 ptd4-apoptin融合蛋白 U14宫颈癌细胞 小鼠宫颈癌原位瘤模型 凋亡

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