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大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备
被引量：
10
1
作者
张平
邢万金
+4 位作者
包晓红
刘志达
王连庆
李舜尧
乌日嘠
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第11期1981-1987,共7页
为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体。采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-...
为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体。采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体。用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价。序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的。本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上。制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000。获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础。
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关键词
rvlg
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
大鼠RVLG选择性剪接变异体的鉴定和分析
2
作者
黄文强
董珍珍
邢万金
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第7期1474-1480,共7页
【目的】确认大鼠RVLG(rat vasa-like gene)的第7、8两个内含子的部分片段在卵巢中可能存在选择性剪接现象,进一步检测大鼠RVLG的第7、8两个内含子在卵巢和睾丸中的选择性剪接形式。【方法】从雌雄各5只Wistar大鼠的卵巢和睾丸组织中提...
【目的】确认大鼠RVLG(rat vasa-like gene)的第7、8两个内含子的部分片段在卵巢中可能存在选择性剪接现象,进一步检测大鼠RVLG的第7、8两个内含子在卵巢和睾丸中的选择性剪接形式。【方法】从雌雄各5只Wistar大鼠的卵巢和睾丸组织中提取总RNA,反转录成cDNA后作为模板,用PCR扩增RVLG起始密码后约620—690 bp的编码区cDNA。分别选卵巢和睾丸各7个独立克隆测序,将测序结果与大鼠RVLG基因组DNA比对,分析是否有选择性剪接。【结果】大鼠卵巢和睾丸组织中各7个RVLG cDNA编码区5′端620—690 bp的片段测序结果均存在45 bp和15 bp两处选择性剪接。在7个卵巢RVLG cDNA独立克隆中,有5个仅存45 bp而缺少15 bp,两个仅存15 bp而缺少45 bp;7个睾丸RVLG cDNA独立克隆中,4个仅存在45 bp而缺少15 bp,两个既含有15 bp又含有45 bp,一个既没有45 bp也没有15 bp。经与大鼠RVLG基因组DNA序列比对后确认45 bp位于其第7内含子5′端的两个GT之间,15 bp位于第8内含子3′端的两个AG之间,剪掉或保留这两段均符合典型的GT-AG内含子剪接原则,属选择性剪接。【结论】大鼠RVLG的第7、8两个内含子在卵巢和睾丸中均存在多种选择性剪接形式,体内的标准剪接方式应该是第7外显子3′端保留45 bp,第9外显子不保留来自第8内含子的15 bp。
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关键词
rvlg
RT-PCR
选择性剪接
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职称材料
题名
大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备
被引量：
10
1
作者
张平
邢万金
包晓红
刘志达
王连庆
李舜尧
乌日嘠
机构
内蒙古大学生命科学学院生物系
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第11期1981-1987,共7页
基金
内蒙古自治区高等学校科学研究项目(No.NJ05026)资助~~
文摘
为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体。采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体。用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价。序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的。本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上。制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000。获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础。
关键词
rvlg
原核表达
多克隆抗体
Keywords
rvlg
, prokaryotic expression, polyclonal antibody
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
大鼠RVLG选择性剪接变异体的鉴定和分析
2
作者
黄文强
董珍珍
邢万金
机构
内蒙古大学生命科学学院/哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室
出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第7期1474-1480,共7页
基金
国家自然科学基金项目(30960174)
国家基础科学人才培养基金项目(J0730648)
国家大学生创新基金项目(101012603)
文摘
【目的】确认大鼠RVLG(rat vasa-like gene)的第7、8两个内含子的部分片段在卵巢中可能存在选择性剪接现象,进一步检测大鼠RVLG的第7、8两个内含子在卵巢和睾丸中的选择性剪接形式。【方法】从雌雄各5只Wistar大鼠的卵巢和睾丸组织中提取总RNA,反转录成cDNA后作为模板,用PCR扩增RVLG起始密码后约620—690 bp的编码区cDNA。分别选卵巢和睾丸各7个独立克隆测序,将测序结果与大鼠RVLG基因组DNA比对,分析是否有选择性剪接。【结果】大鼠卵巢和睾丸组织中各7个RVLG cDNA编码区5′端620—690 bp的片段测序结果均存在45 bp和15 bp两处选择性剪接。在7个卵巢RVLG cDNA独立克隆中,有5个仅存45 bp而缺少15 bp,两个仅存15 bp而缺少45 bp;7个睾丸RVLG cDNA独立克隆中,4个仅存在45 bp而缺少15 bp,两个既含有15 bp又含有45 bp,一个既没有45 bp也没有15 bp。经与大鼠RVLG基因组DNA序列比对后确认45 bp位于其第7内含子5′端的两个GT之间,15 bp位于第8内含子3′端的两个AG之间,剪掉或保留这两段均符合典型的GT-AG内含子剪接原则,属选择性剪接。【结论】大鼠RVLG的第7、8两个内含子在卵巢和睾丸中均存在多种选择性剪接形式,体内的标准剪接方式应该是第7外显子3′端保留45 bp,第9外显子不保留来自第8内含子的15 bp。
关键词
rvlg
RT-PCR
选择性剪接
Keywords
rvlg
RT-PCR
alternative splicing
分类号
S865.12 [农业科学—野生动物驯养]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备
张平
邢万金
包晓红
刘志达
王连庆
李舜尧
乌日嘠
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008
10
下载PDF
职称材料
2
大鼠RVLG选择性剪接变异体的鉴定和分析
黄文强
董珍珍
邢万金
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2011
0
下载PDF
职称材料
已选择
0
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