目的:探讨大黄素对脂多糖(LPS)诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)骨架及通透性影响的作用机制。方法:HUECs分为五组:正常对照组、内皮炎症损伤模型组(0.2μg/m L LPS)、大黄素干预组(10μmol/L大黄素+0.2μg/m L LPS)、抑制剂对照...目的:探讨大黄素对脂多糖(LPS)诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)骨架及通透性影响的作用机制。方法:HUECs分为五组:正常对照组、内皮炎症损伤模型组(0.2μg/m L LPS)、大黄素干预组(10μmol/L大黄素+0.2μg/m L LPS)、抑制剂对照组(0.2μg/m L LPS+50μmol/L Y27632)、西药对照组(10-5mol/L缬沙坦+0.2μg/m L LPS)。首先,以内皮细胞生物学功能PCR基因芯片技术筛选可能的基因改变。结合基因芯片结果和文献中各基因功能,拟定观察Rho/ROCK通路相关的和可能涉及调节细胞骨架的基因,如纤连蛋白(FN)、整合素A5(ITGA5)、Ras同源基因家族成员(Rho A)、肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、黏着斑激酶(FAK)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的m RNA表达水平,进行实时荧光定量PCR验证,同时以Western blotting对ITGA5、Rho A、4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和磷酸化的肌球蛋白轻链(PMLC)进行蛋白水平的研究。结果:1LPS组Rho/ROCK通路相关基因(FN、ITGA5、Rho A、MLCP、PI3K、FAK、VEGF、VEGFR2)表达显著升高,ITGA5、Rho A、PIP2、PMLC的蛋白表达亦升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2与LPS组比较,Y27632组、缬沙坦组的FN、ITGA5、Rho A、PI3K、FAK、VEGF、VEGFR2基因表达下降,MLCP表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05);ITGA5、PIP2的蛋白表达下降;缬沙坦组PMLC表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3与LPS组比较,大黄素组FN、PI3K、FAK表达降低,MLCP表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05);PIP2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LPS可激活Rho/ROCK信号通路,成功构建HUVECs内皮损伤模型;Y27632和缬沙坦可阻断Rho/ROCK通路,对细胞骨架有较强的保护作用;大黄素可轻度抑制Rho/ROCK通路,同时可能通过调节PI3K、MLCP表达而影响其他通路(如AKT和/或FAK-PI3K信号通路)从而发挥对内皮细胞损伤的干预作用。展开更多
文摘目的:探讨大黄素对脂多糖(LPS)诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)骨架及通透性影响的作用机制。方法:HUECs分为五组:正常对照组、内皮炎症损伤模型组(0.2μg/m L LPS)、大黄素干预组(10μmol/L大黄素+0.2μg/m L LPS)、抑制剂对照组(0.2μg/m L LPS+50μmol/L Y27632)、西药对照组(10-5mol/L缬沙坦+0.2μg/m L LPS)。首先,以内皮细胞生物学功能PCR基因芯片技术筛选可能的基因改变。结合基因芯片结果和文献中各基因功能,拟定观察Rho/ROCK通路相关的和可能涉及调节细胞骨架的基因,如纤连蛋白(FN)、整合素A5(ITGA5)、Ras同源基因家族成员(Rho A)、肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、黏着斑激酶(FAK)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的m RNA表达水平,进行实时荧光定量PCR验证,同时以Western blotting对ITGA5、Rho A、4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和磷酸化的肌球蛋白轻链(PMLC)进行蛋白水平的研究。结果:1LPS组Rho/ROCK通路相关基因(FN、ITGA5、Rho A、MLCP、PI3K、FAK、VEGF、VEGFR2)表达显著升高,ITGA5、Rho A、PIP2、PMLC的蛋白表达亦升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2与LPS组比较,Y27632组、缬沙坦组的FN、ITGA5、Rho A、PI3K、FAK、VEGF、VEGFR2基因表达下降,MLCP表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05);ITGA5、PIP2的蛋白表达下降;缬沙坦组PMLC表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3与LPS组比较,大黄素组FN、PI3K、FAK表达降低,MLCP表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05);PIP2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LPS可激活Rho/ROCK信号通路,成功构建HUVECs内皮损伤模型;Y27632和缬沙坦可阻断Rho/ROCK通路,对细胞骨架有较强的保护作用;大黄素可轻度抑制Rho/ROCK通路,同时可能通过调节PI3K、MLCP表达而影响其他通路(如AKT和/或FAK-PI3K信号通路)从而发挥对内皮细胞损伤的干预作用。
