目的研究小分子干扰RNA(SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施。方法体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Tr...目的研究小分子干扰RNA(SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施。方法体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipofectamine2000转染A549细胞。将细胞随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组、干扰后高氧组4组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧(92%O2,5%CO2)中;空气组仍置于5%CO2培养箱中。4组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA。采用半定量RT-PCR测定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6,8(ATPase 6、8)及细胞色素C(CytC)mRNA的表达;Western-blot检测Trx-2蛋白表达;流式细胞术检测高氧和沉默Trx-2对A549细胞凋亡的影响。结果序列特异性SiRNA可抑制Trx-2表达,SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3组Trx-2蛋白表达均受到抑制,SiRNA-1组抑制效率最高(79.51%)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12 h CytC和24 h Trx-2 mRNA的表达增高,48 h CytC mRNA的表达降低(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,但在12、24 h CytC mRNA表达水平升高(P<0.05)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12、48 hATPase 6 mRNA的表达增高,24、48 h ATPase 8 mRNA的表达增高(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h ATPase 6,8 mRNA的表达减弱(P<0.05)。干扰后高氧组24、48 h A549细胞凋亡百分数明显高于干扰后空气组(P<0.05)。结论高氧暴露和沉默Trx-2导致A549细胞ATPase 6,8表达下调和CytC表达升高,表明能量代谢障碍和细胞凋亡参与高氧肺损伤发病过程,Trx-2对高氧肺损伤线粒体起重要的保护作用。展开更多
运用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC...运用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用。分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近。qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用。展开更多
文摘目的研究小分子干扰RNA(SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施。方法体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipofectamine2000转染A549细胞。将细胞随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组、干扰后高氧组4组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧(92%O2,5%CO2)中;空气组仍置于5%CO2培养箱中。4组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA。采用半定量RT-PCR测定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6,8(ATPase 6、8)及细胞色素C(CytC)mRNA的表达;Western-blot检测Trx-2蛋白表达;流式细胞术检测高氧和沉默Trx-2对A549细胞凋亡的影响。结果序列特异性SiRNA可抑制Trx-2表达,SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3组Trx-2蛋白表达均受到抑制,SiRNA-1组抑制效率最高(79.51%)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12 h CytC和24 h Trx-2 mRNA的表达增高,48 h CytC mRNA的表达降低(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,但在12、24 h CytC mRNA表达水平升高(P<0.05)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12、48 hATPase 6 mRNA的表达增高,24、48 h ATPase 8 mRNA的表达增高(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h ATPase 6,8 mRNA的表达减弱(P<0.05)。干扰后高氧组24、48 h A549细胞凋亡百分数明显高于干扰后空气组(P<0.05)。结论高氧暴露和沉默Trx-2导致A549细胞ATPase 6,8表达下调和CytC表达升高,表明能量代谢障碍和细胞凋亡参与高氧肺损伤发病过程,Trx-2对高氧肺损伤线粒体起重要的保护作用。
文摘运用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用。分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近。qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用。
