-
题名H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化
- 1
-
-
作者
刘郁夫
郝文茜
冯美莹
欧阳征亮
陈瑞爱
-
机构
肇庆学院生命科学学院
岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心
农业农村部兽用生物制品工艺技术重点实验室/广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室/肇庆大华农生物药品有限公司
-
出处
《广东农业科学》
CAS
2023年第10期149-156,共8页
-
基金
广东省重点领域研发计划项目(2021B0707010009)
广东省普通高校特色创新项目(2022KTSCX148)
肇庆学院博士启动项目(21010117)。
-
文摘
【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。
-
关键词
H7亚型禽流感病毒
血凝素蛋白(ha)
昆虫细胞
杆状病毒
基因表达
蛋白纯化
-
Keywords
H7 subtype avain influenza viruses
hemagglutinin(ha)
insect cell
baculovirus
gene expression
protein purification
-
分类号
S855.3
[农业科学—临床兽医学]
-
