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FLAG Pull-down技术筛选人乳腺癌细胞中NGAL相互作用蛋白 被引量：1
1
作者 毛山山 程小珍 +2 位作者 崔荣花 元建华 王美清 《海南医学》 CAS 2017年第17期2753-2756,共4页
目的构建含有NGAL基因的p3XFLAG-NGAL真核表达载体并对其进行鉴定,获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白。方法提取MCF7细胞中总RNA,反转录为c DNA后采用聚合酶链反应扩增NGAL基因,上下游分别引入NotⅠ和Eco RⅠ酶切位点,双酶切后将... 目的构建含有NGAL基因的p3XFLAG-NGAL真核表达载体并对其进行鉴定,获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白。方法提取MCF7细胞中总RNA,反转录为c DNA后采用聚合酶链反应扩增NGAL基因,上下游分别引入NotⅠ和Eco RⅠ酶切位点,双酶切后将其插入p3XFLAG-CMV-14质粒中,构建p3XFLAGNGAL重组质粒,并进行双酶切和测序鉴定。采用脂质体法转染该质粒至MCF7细胞中,经Western blot检测FLAG-NGAL融合蛋白的表达情况。再使用FLAG pull-down技术和蛋白质谱测定获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白。结果经过NotⅠ和Eco RⅠ双酶切及DNA测序验证,本研究成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,免疫印迹法证实转染了p3XFLAG-NGAL载体的人乳腺癌细胞MCF7高表达FLAG-NGAL融合蛋白,并利用FLAG pull-down技术筛选出人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白,经蛋白质谱测定为角蛋白-1(Keratin 1,KRT1)。结论成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,并获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白KRT1,为下一步研究乳腺癌的发生、发展机制提供新的思路和靶点。 展开更多
关键词 乳腺癌 p3xflag载体 相互作用蛋白
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