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重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析 被引量：1
1
作者 王萍 丁世萍 李继承 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期172-176,共5页
目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性。方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达。用金属螯合层析法纯化重组蛋白。... 目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性。方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达。用金属螯合层析法纯化重组蛋白。薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量。间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价。Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性。结果1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高(占细菌总蛋白量的36%),主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1∶4 960和1∶5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性。结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列。重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系。 展开更多
关键词 pet-29b-tcs重组表达载体 重组天花粉蛋白 天然天花粉蛋白 免疫原性 逆转录聚合酶连反应
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TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定
2
作者 陈桂华 李翔辉 郁川 《现代农业研究》 2019年第11期96-98,共3页
为得到TAT-Apoptin融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin为模板PCR扩增出TATApoptin基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin蛋白进行表达。PCR和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋... 为得到TAT-Apoptin融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin为模板PCR扩增出TATApoptin基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin蛋白进行表达。PCR和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋白能与Apoptin多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin基因原核表达载体构建成功,并能在Rosetta中进行分泌性表达。 展开更多
关键词 TAT-Apoptin融合蛋白 重组载体pet-32a-TAT-Apoptin 分泌性表达
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TrkA膜外域各结构域重组蛋白的制备和活性测定
3
作者 郭超 阎志勇 +4 位作者 由振东 张勇 曹莉 路长林 何成 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期853-855,共3页
目的 :制备有活性的 Trk A膜外域各结构域重组蛋白。 方法 :用 PCR法克隆 Trk A膜外域各结构域 (分别命名为CL C、Ig1和 Ig2 )的 c DNA片段 ,然后插入融合表达载体 p ET- 2 8a(+)中 ,经测序证实后 ,转入大肠杆菌 BL2 1中表达 ,并用亲和... 目的 :制备有活性的 Trk A膜外域各结构域重组蛋白。 方法 :用 PCR法克隆 Trk A膜外域各结构域 (分别命名为CL C、Ig1和 Ig2 )的 c DNA片段 ,然后插入融合表达载体 p ET- 2 8a(+)中 ,经测序证实后 ,转入大肠杆菌 BL2 1中表达 ,并用亲和层析法进行纯化 ,用神经生长因子 (NGF)诱导 PC12细胞株测定 Trk A与配体结合的关键结构域 (CL C、Ig1和 Ig2 )活性。结果 :成功地用大肠杆菌制备了纯度达 90 %以上的 Trk A膜外域各结构域重组蛋白 ;NGF+Ig2组 PC12细胞突起生长率明显低于 NGF组 (P<0 .0 5 ) ,NGF+CL C、NGF+Ig1组与 NGF组相比没有显著差异。 结论 :Ig2能抑制经 NGF诱导的 PC12细胞的分化 ,CL C和 Ig1不能抑制 展开更多
关键词 TrkA膜外域 结构域重组蛋白 制备 活性测定 融合表达载体 pet-28a(+)
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