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小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定
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作者 辛晨 况春燕 刘兴德 《贵州医科大学学报》 CAS 2023年第9期1013-1019,1046,共8页
目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,... 目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,采用限制性内切酶进行酶切,线性化后连接siRNA片段,获得重组腺病毒载体shRNA-Slfn3,从中筛选阳性克隆抽提质粒,进行DNA测序验证;取对数生长期的人胚胎肾细胞HEK293,采用Admax系统将目的质粒转染至HEK293细胞,获得重组腺病毒shRNA-Slfn3后进行小量扩增及病毒滴度测定;取小鼠脾脏单个核细胞体外培养至对数期EPCs,用前述所得重组腺病毒shRNA-Slfn3对其进行转染48 h,采用绿色荧光蛋白量检测重组腺病毒的转染效率。结果测序验证3组目的质粒构建成功;获得shRNA-Slfn3重组腺病毒,病毒滴度分别为2.37×10^(13)pfu/L、3.16×10^(13)pfu/L及4.74×10^(13)pfu/L;EPCs转染效率为(63.64±2.58)%。结论成功构建了小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体,转染小鼠脾源EPCs后的转染效率较高。 展开更多
关键词 内皮祖细胞 基因敲低技术 slfn3基因 短发夹RNA 载体构建 包装
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