【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促...【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先,从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱(circular dichroism,CD)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和等温微量热仪(isothermal micrometer calorimetry,ITC)分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。【结果】生物信息学分析表明:SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量和排列基序完全一致,仅有8个非Cys位点差异。经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切,成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A。金属耐受性试验表明:与SsMT-2A相比,转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性。CD光谱表明:SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合,两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性,然而,SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力。MALDI-TOF-MS表明:apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为6047.5 Da和6048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定,与Cu(Ⅰ)的结合不稳定。ITC表明:SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定,与Cu(Ⅰ)的结合稳定,两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为7,SsMT-1A结合Zn(Ⅱ)的化学计量数为2。【结论】虽然SsMT-1A和SsMT-2A具有较高的同源性,然而,8个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别。尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为,然而,两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别,两者不应被认为是完全生理等价分子。在生理条件下:SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用,SsMT-2A可能发挥Zn内稳态的调控作用。本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态,发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础。展开更多
目的应用生物信息学方法探究猪重组NK-lysin(prNK-lysin)抑制肝癌细胞转移潜在的作用靶点和通路。方法将肝癌细胞设置为空白对照组,PBS处理组和prNK-lysin处理组,37℃作用6 h后,应用高效液相色谱串联质谱对肽段进行鉴定,按照Foldchange=...目的应用生物信息学方法探究猪重组NK-lysin(prNK-lysin)抑制肝癌细胞转移潜在的作用靶点和通路。方法将肝癌细胞设置为空白对照组,PBS处理组和prNK-lysin处理组,37℃作用6 h后,应用高效液相色谱串联质谱对肽段进行鉴定,按照Foldchange=1.2倍且P<0.05筛选出差异表达蛋白。基于GO、KEGG等数据库对差异表达蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析。运用RT-qPCR验证细胞中多肽-N-乙酰半乳糖胺基转移酶13(GALNT13)、跨膜蛋白51(TMEM51)和FKBP脯酰异构酶3(FKBP3)的mRNA相对表达量。Western blot验证FKBP3的蛋白表达量。结果蛋白组学表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组中有1989个差异表达蛋白;与PBS处理组相比,prNK-lysin处理组中有2753个差异表达蛋白;PBS处理组和空白对照组相比,有15个差异表达蛋白。相对于PBS处理组和空白对照组,prNK-lysin处理组中共有1909个差异表达蛋白。GO和KEGG分析表明差异表达蛋白主要参与Viral process、translational initiation、RNAbinding等过程,主要富集于Ribosome、Protein process in endoplasmic reticulum、RNA transport等通路。RT-qPCR表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组显著升高了细胞内GALNT13(1.54±0.06 vs 1.02±0.17,P<0.05)和TMEM51(1.27±0.07 vs 1.00±0.04,P<0.01)的mRNA相对表达量,显著降低了FKBP3(0.43±0.06 vs 1.02±0.24,P<0.05)的mRNA相对表达量。Western blotting表明prNK-lysin处理组与空白对照组相比显著降低了细胞内FKBP3(0.68±0.02 vs 1.02±0.03,P<0.001)的蛋白表达量。结论prNK-lysin处理后肝癌细胞SMMOL/LC-7721的蛋白质组与空白组相比发生显著变化,prNK-lysin作用于FKBP3蛋白,并能通过影响细胞内氧化磷酸化和糖酵解等通路发挥其抑制作用。展开更多
文摘【目的】利用网络药理学和分子对接技术发现莪术醇抗脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的作用靶点及机制。【方法】利用PharmMapper、GeneCards数据库获得莪术醇抗EMCV的相关靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件、STRING和DAVID数据库构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建莪术醇抗EMCV靶点-通路网络;通过AutoDock Vina 1.1.2分析莪术醇与靶蛋白的结合能及结合模式。【结果】网络药理学分析结果显示,莪术醇抗EMCV的潜在靶点有9个,其中丝裂原活化激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、白蛋白(albumin,ALB)、白细胞介素2(interleukin 2,IL2)可能是莪术醇抗EMCV的核心靶点,所得靶点参与C型凝集素受体信号通路、神经营养素信号通路和JAK-STAT信号通路等代谢通路,功能涉及调节炎症反应细胞因子的产生、蛋白激酶活性和药物结合等;分子对接结果显示,4种核心靶蛋白与莪术醇之间存在较强的结合能,均存在疏水形式的结合,其中ALB、STAT1和IL2与莪术醇之间还存在氢键结合。【结论】本研究结果表明,MAPK14、STAT1、ALB和IL2是莪术醇发挥抗EMCV作用的潜在靶点,本研究为莪术醇作为抗EMCV药物的研发提供理论依据和线索。
文摘【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先,从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱(circular dichroism,CD)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和等温微量热仪(isothermal micrometer calorimetry,ITC)分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。【结果】生物信息学分析表明:SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量和排列基序完全一致,仅有8个非Cys位点差异。经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切,成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A。金属耐受性试验表明:与SsMT-2A相比,转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性。CD光谱表明:SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合,两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性,然而,SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力。MALDI-TOF-MS表明:apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为6047.5 Da和6048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定,与Cu(Ⅰ)的结合不稳定。ITC表明:SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定,与Cu(Ⅰ)的结合稳定,两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为7,SsMT-1A结合Zn(Ⅱ)的化学计量数为2。【结论】虽然SsMT-1A和SsMT-2A具有较高的同源性,然而,8个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别。尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为,然而,两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别,两者不应被认为是完全生理等价分子。在生理条件下:SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用,SsMT-2A可能发挥Zn内稳态的调控作用。本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态,发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础。
文摘目的应用生物信息学方法探究猪重组NK-lysin(prNK-lysin)抑制肝癌细胞转移潜在的作用靶点和通路。方法将肝癌细胞设置为空白对照组,PBS处理组和prNK-lysin处理组,37℃作用6 h后,应用高效液相色谱串联质谱对肽段进行鉴定,按照Foldchange=1.2倍且P<0.05筛选出差异表达蛋白。基于GO、KEGG等数据库对差异表达蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析。运用RT-qPCR验证细胞中多肽-N-乙酰半乳糖胺基转移酶13(GALNT13)、跨膜蛋白51(TMEM51)和FKBP脯酰异构酶3(FKBP3)的mRNA相对表达量。Western blot验证FKBP3的蛋白表达量。结果蛋白组学表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组中有1989个差异表达蛋白;与PBS处理组相比,prNK-lysin处理组中有2753个差异表达蛋白;PBS处理组和空白对照组相比,有15个差异表达蛋白。相对于PBS处理组和空白对照组,prNK-lysin处理组中共有1909个差异表达蛋白。GO和KEGG分析表明差异表达蛋白主要参与Viral process、translational initiation、RNAbinding等过程,主要富集于Ribosome、Protein process in endoplasmic reticulum、RNA transport等通路。RT-qPCR表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组显著升高了细胞内GALNT13(1.54±0.06 vs 1.02±0.17,P<0.05)和TMEM51(1.27±0.07 vs 1.00±0.04,P<0.01)的mRNA相对表达量,显著降低了FKBP3(0.43±0.06 vs 1.02±0.24,P<0.05)的mRNA相对表达量。Western blotting表明prNK-lysin处理组与空白对照组相比显著降低了细胞内FKBP3(0.68±0.02 vs 1.02±0.03,P<0.001)的蛋白表达量。结论prNK-lysin处理后肝癌细胞SMMOL/LC-7721的蛋白质组与空白组相比发生显著变化,prNK-lysin作用于FKBP3蛋白,并能通过影响细胞内氧化磷酸化和糖酵解等通路发挥其抑制作用。
