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促红细胞生成素基因表达载体的构建及其在CHO细胞中表达的研究 被引量：2
1
作者 崔振中 沈恒 +2 位作者 刘维全 刘朋朋 齐顺章 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期691-696,共6页
用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因，构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ，ｐＲＳＶ／ＥＰＯ，ｐＣＭＶ／ＥＰＯ，在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接... 用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因，构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ，ｐＲＳＶ／ＥＰＯ，ｐＣＭＶ／ＥＰＯ，在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接、５′非翻译区和３′非翻译区对基因表达的影响等因素都加以考虑．用脂质体转染法分别将上述３个载体导入ＣＨＯ细胞，经瞬时表达，用ＥＬＩＳＡ方法检测，表达量分别为１９０ｍＩＵ／ｍｌ、１６０ｍＩＵ／ｍｌ、４４７ｍＩＵ／ｍｌ．用表达载体ｐＯＰ１３／ＥＰＯ转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞，在４００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８浓度下筛选稳定表达细胞克隆，获得了表达量约为１６０ＩＵ／１０６细胞（４８ｈ）的Ｃ１０细胞株．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现了ＥＰＯ阳性条带．用ＴＦ－１细胞对ＥＰＯ进行了生物活性检测，初步证实所表达的ＥＰＯ有生物活性． 展开更多
关键词 促红细胞生成素 CHO细胞 瞬时表达 稳定表达
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人促红细胞生成素基因组基因的克隆及全序列分析 被引量：1
2
作者 崔振中 寿思明 +2 位作者 朱宝利 刘朋朋 齐顺章 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期684-690,共7页
为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因，从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达，从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ，构建了不完全基因组噬菌体文库，文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因... 为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因，从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达，从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ，构建了不完全基因组噬菌体文库，文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因组ＤＮＡ进行完全酶切，回收１０．５ｋｂ左右的酶切片段，插入到λ－噬菌体ＥＭＢＬ３载体中．筛选文库所使用的探针是用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ模板中扩增的５５６ｂｐ的ＥＰＯ基因片段．从该文库中筛选到了一个含有完整ＥＰＯ基因的插入片段长度为１２．５ｋｂ的阳性克隆．经全序列分析证实，所克隆的ＥＰＯ基因编码正确，但在５′－侧翼及第一内含子处与国外发表的序列相比较，发现两处核苷酸差异，这两个核苷酸的差异改变了５′－调控区的两个小的开放阅读框——ＯＲＦ１和ＯＲＦ３，其在基因表达调探方面的作用值得进一步探讨． 展开更多
关键词 基因文库 促红细胞生成素 PCR 序列分析 EPO 人
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GFP-pl6融合基因表达载体的构建
3
作者 李华 刘维全 +2 位作者 崔振中 金春元 王太一 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 1997年第2期125-128,共4页
本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。
关键词 融合基因 表达载体 转基因动物模型 P16基因 GFP基因 CG 构建 目的基因 重组体 绿色荧光蛋白
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GFP转基因指示系统建立的研究 被引量：5
4
作者 李华 刘维全 +4 位作者 涂长春 崔振中 莫日根 苟鸿鹰 王太一 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 1998年第1期51-55,共5页
ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）是存在于发光水母体内的一种吸收蓝光或紫外光（３９５ｎｍ）后能够发出绿色荧光的天然蛋白质。本文报道了将ＧＦＰ表达质粒导入ＢＨＫ、ＤＫ、ＲＫ等真核细胞，建立ＧＦＰ真核细胞转基因指示系统。研究表明，Ｇ... ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）是存在于发光水母体内的一种吸收蓝光或紫外光（３９５ｎｍ）后能够发出绿色荧光的天然蛋白质。本文报道了将ＧＦＰ表达质粒导入ＢＨＫ、ＤＫ、ＲＫ等真核细胞，建立ＧＦＰ真核细胞转基因指示系统。研究表明，ＧＦＰ在ＢＨＫ、ＤＫ、ＲＫ等传代细胞中表达的最佳条件是３３℃，ｐＨ７．２、５％ＣＯ２和转染后４８ｈ观察等。并对野生型ＧＦＰ和突变型ＧＦＰ的发光强度进行了比较，结果表明，在相同条件下。 展开更多
关键词 突变型 GFP 真核细胞 体内 转染 野生型 观察 水母 绿色荧光蛋白 转基因
全文增补中
GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究
5
作者 李华 王禄增 +2 位作者 刘维全 崔振中 王太一 《中国实验动物学杂志》 1998年第1期10-13,共4页
本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的ＧＦＰ－ｐ１６融合基因表达载体ｐＣｐ１６Ｇ和ｐＣＧｐ１６分别导入ＢＨＫ、ＨｅＬａ细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达。结果表明，外源脂质体对ＢＨＫ、ＨｅＬａ等真核细胞无... 本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的ＧＦＰ－ｐ１６融合基因表达载体ｐＣｐ１６Ｇ和ｐＣＧｐ１６分别导入ＢＨＫ、ＨｅＬａ细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达。结果表明，外源脂质体对ＢＨＫ、ＨｅＬａ等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，ｐ１６基因与ＧＦＰ基因的３′端连接，可以保持ＧＦＰ的荧光特性，表达荧光蛋白，而与ＧＦＰ基因的５′端连接，则不能表达荧光。 展开更多
关键词 HELA细胞 表达载体 融合基因 荧光蛋白 脂质体转染 真核细胞 p16基因 GFP基因 外源基因 细胞基因
全文增补中
定点突变的人胰岛素基因在CHO细胞表达的研究 被引量：2
6
作者 寿思明 朱宝利 +1 位作者 崔振中 齐顺章 《中国糖尿病杂志》 CAS CSCD 1999年第5期269-272,共4页
目的　研究在哺乳动物细胞中表达人胰岛素。方法　采用寡核苷酸介导的定点突变方法，改造人胰岛素基因组基因，将哺乳动物细胞内蛋白质前体加工酶Ｆｕｒｉｎ 的识别和切割位点Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－样序列，引入人胰岛素原Ｃ肽... 目的　研究在哺乳动物细胞中表达人胰岛素。方法　采用寡核苷酸介导的定点突变方法，改造人胰岛素基因组基因，将哺乳动物细胞内蛋白质前体加工酶Ｆｕｒｉｎ 的识别和切割位点Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－样序列，引入人胰岛素原Ｃ肽两端，在普通ＣＨＯ细胞表达了该改造后的基因。结果　首先应用突变引物Ⅰ：ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣ，引物Ⅱ：ＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣ，按照Ｋｕｎｋｅｌ的方法，成功地进行了人胰岛素基因上两个位点的同时突变改造。利用表达载体ＰＲＣ／ＣＭＶ和突变后的胰岛素基因，构建成表达载体ＣＭＶ／ＭＩＮＳ，并在ＣＨＯ细胞中获得了表达。结论　用ＲＩＡ法检测在暂态表达的ＣＨＯ细胞培养液中人胰岛素的表达量为５．５～７０．０μＩＵ／５×１０６ 细胞·ｄ－ １。同时，还利用Ｇ４１８进行了胰岛素表达细胞株的筛选，筛选出的ＣＨＯ细胞株的表达量为：６．５～２５．５μＩＵ／５×１０６细胞·ｄ－ １。 展开更多
关键词 人胰岛素 定点突变 基因表达 CHO细胞 糖尿病
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转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究 被引量：1
7
作者 寿思明 陈英 +2 位作者 朱宝利 敖红 齐顺章 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期248-251,共4页
转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点，目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白... 转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点，目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶... 展开更多
关键词 启动子 胰岛素 基因 转基因小鼠 暂态表达
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用富集文库克隆人胰岛素基因组基因 被引量：1
8
作者 寿思明 朱宝利 齐顺章 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第2期194-199,共6页
通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库，克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ，用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切，经０．４％琼脂糖凝胶电泳，特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮ... 通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库，克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ，用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切，经０．４％琼脂糖凝胶电泳，特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接，构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库），效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′，引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′，从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段，做为放射性标记探针，对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选，从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆，并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定． 展开更多
关键词 基因文库 人胰岛素基因 序列分析
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用dhfr非缺陷型细胞高效表达EPO基因的研究
9
作者 崔振中 刘朋朋 +1 位作者 齐顺章 沈恒 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 1998年第20期2187-2192,共6页
用我们所克隆的促红细胞生成素 (EPO)基因组基因 ,构建了表达载体 pRSV/EPO .用脂质体法转染CHO K1 2细胞 ,在 40 0 μg/mL的G41 8浓度下筛选到了稳定表达EPO的细胞株 ,表达量约为每天每 1 0 6细胞 1 6 0IU .在此基础上又构建了带有潮霉... 用我们所克隆的促红细胞生成素 (EPO)基因组基因 ,构建了表达载体 pRSV/EPO .用脂质体法转染CHO K1 2细胞 ,在 40 0 μg/mL的G41 8浓度下筛选到了稳定表达EPO的细胞株 ,表达量约为每天每 1 0 6细胞 1 6 0IU .在此基础上又构建了带有潮霉素B抗性的二氢叶酸还原酶 (dhfr)基因表达载体 pHY/dhfr,再将这一表达载体用脂质体方法导入C1 0细胞中 ,经2 0 0 μg/mL的潮霉素B筛选 ,获得了部分潮霉素B抗性的细胞株 ,这些细胞株既能表达EPO又能表达外源的dhfr基因 ,经 1 μmol的氨甲喋呤 (MTX)加压筛选 ,获得了表达量为每天每1 0 6细胞 2 40 0IU的高表达细胞克隆 ,表达量提高了 1 0～ 1 5倍 .初步建立了用非dhfr缺陷型细胞高效表达外源基因的方法 ,这一方法在生产上有实际意义 ,在理论上值得进一步研究 .用TF 1细胞对EPO进行了生物活性检测 。 展开更多
关键词 促红细胞生成素 非缺陷型细胞 DHFR 基因表达
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