猪源和犬源ELF4蛋白的亚细胞定位比较研究

1

作者 高翠翠 喻娇 +8 位作者 唐青海 侯鑫军 刘婷 全飞杨 刘建行 赵婷芳 赵铖 朱钰英 危艳武 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第3期45-53,共9页

本研究旨在对比分析猪E74样因子4(sELF4)和犬E74样因子4(cELF4)的亚细胞定位,为深入开展二者功能研究提供依据。利用PCR截短扩增sELF4和cELF4,分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建17个sELF4重组真核表达载体和13个cELF4重组真核表达... 本研究旨在对比分析猪E74样因子4(sELF4)和犬E74样因子4(cELF4)的亚细胞定位,为深入开展二者功能研究提供依据。利用PCR截短扩增sELF4和cELF4,分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建17个sELF4重组真核表达载体和13个cELF4重组真核表达质粒,转染HeLa细胞、Hoechst33342染色,荧光倒置显微镜观察亚细胞定位,运用生物信息学软件分析其编码氨基酸序列特征。结果表明,sELF4和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,sELF4 196~291 aa(586~873 bp)之间有可能存在两个细胞质核定位信号肽,cELF4的核定位信号肽分布在203~291 aa(607~873 bp),cELF4 292~663 aa(874~1 992 bp)、sELF4 292~662 aa(874~1 989 bp)在细胞中发生聚集现象。cELF4与sELF4氨基酸序列在第169~303位氨基酸之间均高度保守,其他区段均存在不同程度的差异。综上,sELF4蛋白全长和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,截短表达的羧基端功能区有聚集现象,二者的核定位信号肽分布有一定差异。 展开更多

关键词 猪ELF4蛋白 犬ELF4蛋白 真核表达 亚细胞定位

下载PDF 职称材料

H5N1亚型禽流感病毒的鸭致病性研究 被引量：25

2

作者 刘超男 刘明 +2 位作者 张云 刘春国 高雪丽 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期412-417,共6页

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(... 【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气管、泄殖腔及全身各主要器官均可分离到病毒。虽然攻毒后14d耐过鸭血清中可检测到1∶16的HI抗体;但是此时胰腺中仍然可分离到低水平的病毒。【结论】本研究继从野鸟分离到对鸭具有高致病性禽流感病毒之后,首次证实家禽中也存在对鸭具有高致病性的禽流感病毒流行。 展开更多

关键词 禽流感病毒 鸭流感 鹅源 H5N1亚型

下载PDF 职称材料

高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究 被引量：10

3

作者 范培虎 危艳武 +3 位作者 郭龙军 吴洪丽 黄立平 刘长明 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第18期3859-3872,共14页

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、H... 【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。【结果】HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。【结论】HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用,且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2型 共感染 协同致病性

下载PDF 职称材料

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LH2/01/10纤突蛋白基因的遗传变异 被引量：8

4

作者 刘胜旺 刘玉芬 +1 位作者 孔宪刚 刘宝全 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期306-312,共7页

对传染性支气管炎病毒LH2/01/10的S1和S2基因分别进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明,其S基因由3 495个核苷酸组成,编码的多肽由1 164个氨基酸残基组成。S蛋白的切割识别位点氨基酸组成为组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(HRR... 对传染性支气管炎病毒LH2/01/10的S1和S2基因分别进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明,其S基因由3 495个核苷酸组成,编码的多肽由1 164个氨基酸残基组成。S蛋白的切割识别位点氨基酸组成为组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(HRRRR)。推测其裂解后形成的S1和S2亚单位中,S1由539个氨基酸残基组成,S2由625个氨基酸残基组成。序列分析发现:LH2/01/10与Beau、M41、CU-T2、D1466、DE072、Holte、Gray、Ark99、Conn、H52、KB8523、SD/97/02、ZJ971和LX4毒株S基因推导的氨基酸同源性在63%～96%之间。其中与国内分离毒株SD/97/02和LX4氨基酸的同源性均在95%以上,三者切割识别位点也相同。但与另一国内分离株ZJ971氨基酸的同源性仅为75%,而与国外毒株之间在83%以下。切割识别位点也与ZJ971和所选的国外参考毒株代表性的RRF/SRR位点不同。与这些参考毒株相比,LH2/01/10 S基因在76～78位缺失TCT碱基,在67～69位插入TCT碱基,105位和549位氨的基酸发生点突变。总体来看, SD/97/02的S1基因推导的氨基酸序列与国内外已报道的42株参考毒株同源性较低,在52%～96%之间。与国内分离毒株亲缘关系相对较近,其中与国内近年来不同地区分离的A2、LX4、SD/97/02、TJ/96/02、JX/99/01。 展开更多

关键词 鸡 传染性支气管炎病毒 中国分离株 纤突蛋白基因 S基因 遗传变异

下载PDF 职称材料

猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆的构建及拯救毒株的体外生物学特性 被引量：5

5

作者 郭龙军 陆月华 +2 位作者 黄立平 危艳武 刘长明 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第23期4918-4925,共8页

【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结... 【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结果】构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50.mL-1;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应,表明不同基因型代表毒株抗原性不同。【结论】中国猪群中PCV2流行毒株基因组及ORF2长度存在差异,其病毒抗原特性不同,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。 展开更多

关键词 PCV2 不同基因型 感染性克隆 病毒拯救 生物学特性

下载PDF 职称材料

鸭致病性大肠杆菌研究进展 被引量：13

6

作者 孙畅 牛银杰 +4 位作者 尹海畅 徐丽晶 陈洪岩 弥春霞 赵丽丽 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第8期72-77,共6页

近年来,由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的禽大肠杆菌病给全球的养禽行业造成了重大的经济损失,并且APEC引起的禽大肠杆菌病在中国是最主要的家禽细菌病。越来越多的证据显示,APEC是人源尿路感染大肠杆... 近年来,由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的禽大肠杆菌病给全球的养禽行业造成了重大的经济损失,并且APEC引起的禽大肠杆菌病在中国是最主要的家禽细菌病。越来越多的证据显示,APEC是人源尿路感染大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)和致脑膜炎大肠杆菌(neonatal meningitis Escherichia coli,NMEC)的毒力基因储藏库,甚至可能会直接导致两种疾病的发生。因此,如何有效地控制APEC不仅是一个紧迫的问题,更是一个巨大的挑战。对APEC的分离鉴定、流行病学特征、药物敏感性等内容的研究对APEC引起的禽大肠杆菌病的控制具有指导意义。为了更好地防控大肠杆菌病,文章主要从临床症状、病理变化、毒力因子、致病机理和诊断方法几个方面对鸭致病性大肠杆菌进行了综述,以期为进一步研究提供参考。 展开更多

关键词 鸭 大肠杆菌病 毒力因子 致病机理 诊断方法

原文传递

中国猪瘟净化之路:离我们还有多远? 被引量：19

7

作者 孙元 仇华吉 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第21期4169-4176,共8页

猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种以高热、出血和高死亡率为主要特征的接触性传染病,给疫区国家的养猪业造成严重的经济损失。该病被世界动物卫生组织(OIE)列入须申报的动物疫病目录,我国将其列为一类动物疫病。《国家中长期动物疫病防治规... 猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种以高热、出血和高死亡率为主要特征的接触性传染病,给疫区国家的养猪业造成严重的经济损失。该病被世界动物卫生组织(OIE)列入须申报的动物疫病目录,我国将其列为一类动物疫病。《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》将猪瘟列为5种优先防治和重点防范的动物疫病之一。我国老一辈科学家于上世纪50年代研制出闻名于世的猪瘟兔化弱毒疫苗(C株),该疫苗安全、有效,对我国及世界范围内猪瘟的防控和根除发挥了关键作用。截止目前,全球共有30多个国家和地区根除了猪瘟。养猪业在我国畜牧业中占有主导地位,猪瘟对我国生猪及猪肉产品贸易具有重大影响。因此,我国必须走猪瘟净化之路。自上世纪中期我国提出了猪瘟根除战略,时至今日猪瘟仍未净化,主要原因有,我国地域辽阔、养猪环境复杂、养殖模式多样、动物疫病种类繁多、养猪从业人员素质和意识水平参差不齐、生物安全防控水平低等。目前我国已进入新时代,综合国力稳步提升,养殖业也朝着科学化、规模化、绿色环保化方向发展,科研支撑能力日益增强,已完全具备净化猪瘟条件:当前猪瘟的流行率较低;猪瘟疫苗生产工艺不断改进,质量也不断提升;新型猪瘟标记疫苗的研制取得突破性进展;相应的猪瘟检测、监测方法及与标记疫苗配套的鉴别诊断技术也已趋于成熟。更关键的是,我国养猪企业和养殖户也意识到了猪瘟净化的必要性,政府部门也在积极采取行动,制定相应的法规和政策,联合企业、养殖户、各级兽医部门等实施区域性净化。本文详细介绍了猪瘟在全球及我国的流行现状,探讨了我国猪瘟净化的重大意义及有利与不利条件,深入分析了我国猪瘟净化的成本及效益,全面总结了欧盟等国家净化猪瘟的成功经验,并对我国猪瘟净化思路和方案进行了探讨。笔者认为,中国猪瘟净化具有历史必然性、战略必要性、现实可能性、技术可行性,这一天的到来并非遥不可及。 展开更多

关键词 猪瘟 猪瘟病毒 净化 中国

下载PDF 职称材料

H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株组织嗜性的研究 被引量：1

8

作者 董俊斌 步志高 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期668-672,共5页

为了研究H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株[La Sota-HAmut(GD)]的组织嗜性,用重组疫苗[La Sota-HAmut(GD)]人工感染2日龄SPF鸡,接种后定期采集病鸡的各组织器官制备成石蜡切片,用建立的检测石蜡切片中[rLa Sota-HAmu... 为了研究H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株[La Sota-HAmut(GD)]的组织嗜性,用重组疫苗[La Sota-HAmut(GD)]人工感染2日龄SPF鸡,接种后定期采集病鸡的各组织器官制备成石蜡切片,用建立的检测石蜡切片中[rLa Sota-HAmut(GD)]病毒的免疫酶组化染色技术,对人工感染[rLaSota-HAmut(GD)]鸡发病后病毒的组织器官亲嗜性和动态分布规律进行研究。[rLa Sota-HAmut(GD)]在胞浆内复制,主要亲嗜气管黏膜的上皮细胞和固有层腺体细胞,肝小叶间胆管上皮细胞。病毒出现的先后顺序为气管,肝脏,肺脏。结果表明:外源基因HAmut的插入对LaSota疫苗株的组织嗜性的影响很大。 展开更多

关键词 rLa Sota-HAmut(GD) 组织嗜性 研究

下载PDF 职称材料

野猪粪便中乳酸菌的分离鉴定及特性研究 被引量：11

9

作者 王翌 李淼 +2 位作者 李永锋 孙元 仇华吉 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第14期2964-2973,共10页

【目的】筛选安全的、具有优良特性的乳酸菌菌株,进一步研发益生制剂,为饲料添加剂等动物相关产品提供资源。【方法】从我国黑龙江省大兴安岭地区采集野猪粪便样品13份,编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室,利用MRS培养基分离纯化乳酸菌... 【目的】筛选安全的、具有优良特性的乳酸菌菌株,进一步研发益生制剂,为饲料添加剂等动物相关产品提供资源。【方法】从我国黑龙江省大兴安岭地区采集野猪粪便样品13份,编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室,利用MRS培养基分离纯化乳酸菌。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR鉴定,将扩增得到的序列测序后在NCBI上使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析,确定各菌株的分类学地位。将鉴定后的乳酸菌菌株分别接种于酸性(pH 3.0)和含胆盐(0.3%)的MRS培养基,在不同条件下评价乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性。将过夜培养的乳酸菌于室温条件下静置,在不同时间测定其OD600nm,进行自凝集能力评价;过夜培养的菌株分别与致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌混合后于室温静置,进行共凝集能力检测。在体外,分别进行乳酸菌菌株对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞的黏附能力测定,评价不同菌株的黏附能力。通过测定乳酸菌菌株对致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌的抑菌环直径,评价分离菌株的抑菌活性。通过体内外试验评价乳酸菌菌株的安全性。在体外,分别以模式菌株嗜酸乳杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性对照和阳性对照,将3株乳酸菌菌株和对照菌株在血平板上划线,37℃厌氧孵育18—24 h,观察细菌菌落周围是否形成溶菌环,评价分离菌株的溶血特性。使用文献中已报道的毒力因子引物对分离的乳酸菌菌株进行PCR扩增,检测是否存在毒力因子的编码基因,评估分离菌株的安全性。在体内,将过夜培养的乳酸菌连续饲喂7周龄的BALB/c小鼠21 d,分别测定小鼠的初始体重和最终体重,观察计算体重变化情况;饲喂21 d后,解剖获取小鼠的脾脏、肝脏和肾脏计算器官指数,评价分离乳酸菌菌株的体内安全性。【结果】从野猪粪便中分离得到3株对酸和胆盐具备一定耐受力的乳酸菌,经鉴定分别为蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)和黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。3株乳酸菌菌株均表现出较强的自凝集能力和对致病菌的共凝集能力,同时对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞均表现出较强的黏附能力,抑菌试验结果显示黏膜乳杆菌对3种致病菌均具备较强的抑菌活性。经体内外安全性评价,3株乳酸菌菌株无溶血性,且均未检测到毒力基因,经其连续饲喂的小鼠行为表现正常、状态良好,其中,与对照组相比,黏膜乳杆菌饲喂后小鼠增重显著。【结论】从大兴安岭野猪粪便中分离的3株乳酸菌(特别是黏膜乳杆菌)具有良好的特性和安全性,具备进一步开发益生菌制剂的潜力。 展开更多

关键词 野猪 乳酸菌 凝集能力 黏附能力 安全性

下载PDF 职称材料

Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展

10

作者 薛梦迪 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1014-1019,共6页

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。 展开更多

关键词 病毒吸附 模式识别受体 病毒复制 复制过程 病原相关分子模式 第一道防线 病原微生物 流感病毒

下载PDF 职称材料

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾 被引量：84

11

作者 仇华吉 童光志 沈荣显 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期1675-1685,共11页

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的... 猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。 展开更多

关键词 猪瘟 猪瘟病毒 猪瘟兔化弱毒疫苗 20世纪50年代 综合控制措施 细胞免疫应答 被动免疫保护 反向遗传操作 回顾 免疫效力

下载PDF 职称材料

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查 被引量：72

12

作者 高玉龙 邵华斌 +7 位作者 罗青平 潘伟 秦立廷 孙芬芬 刘超男 高宏雷 祁小乐 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期32-35,43,共5页

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进... 为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。 展开更多

关键词 禽白血病 J亚群白血病 血管瘤 ENV基因 分子流行病学

下载PDF 职称材料

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立 被引量：18

13

作者 王云鹤 包红梅 +7 位作者 孙佳善 李雁冰 徐晓龙 王子龙 施建忠 曾显营 王秀荣 陈化兰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第15期3050-3055,共6页

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根... 【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为106.5 EID50·m L-1的H7N9亚型禽流感病毒尿囊液依次进行10倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测H1—H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1—N9亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9亚型AIV样品有特异性目的条带,与其他N1—N9亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为1.4×102.5 EID50·m L-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H7N9亚型 RT-PCR

下载PDF 职称材料

H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立及高产细胞型疫苗株的拯救 被引量：5

14

作者 刘大飞 刘明 +8 位作者 刘春国 杨涛 万春和 陈浩 齐金龙 杜金玲 李洪涛 孙恩成 刘大程 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期1797-1804,共8页

【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株... 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1:512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。 展开更多

关键词 猪流感 H1N1亚型 反向遗传操作技术 细胞培养型流感疫苗

下载PDF 职称材料

非洲猪瘟病毒亲核结构蛋白p10可溶性表达及多克隆抗体制备 被引量：4

15

作者 陈蓉 赵琳 +10 位作者 王婉 谢星 王菁菁 郝飞 白昀 张磊 袁厅 熊琪琰 邵国青 赵东明 冯志新 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2021年第6期42-47,共6页

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒(ASFV)亲核结构蛋白p10,IPTG诱导可表达可溶性重组蛋白p10,分子量约为30 ku。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得重组蛋白p10,且重组蛋白可与ASF阳性血清发生特异性反应。将纯化后的p10作为抗... 利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒(ASFV)亲核结构蛋白p10,IPTG诱导可表达可溶性重组蛋白p10,分子量约为30 ku。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得重组蛋白p10,且重组蛋白可与ASF阳性血清发生特异性反应。将纯化后的p10作为抗原免疫新西兰白兔,分离血清并分析其反应特异性。ELISA检测结果表明,使用重组蛋白p10包被时,所得兔抗血清的效价可达1:204800;使用ASFV病毒裂解物包被,所得兔抗血清的效价可达1:400;表明制备的多克隆抗体能同时与原核表达和ASFV全病毒蛋白反应。IFA检测结果进一步印证多克隆抗体能与ASFV发生特异性反应,表明该抗体具有良好的反应活性和特异性。综上所述,重组p10蛋白和多克隆抗体可为后续建立针对ASFV抗原、抗体的检测方法提供重要的生物材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 亲核结构蛋白p10 可溶性表达 多克隆抗体

下载PDF 职称材料

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用 被引量：3

16

作者 赵青青 李俊平 +8 位作者 梁立滨 黄山雨 周陈陈 赵玉辉 王倩 周圆 姜丽 陈化兰 李呈军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第17期3389-3396,共8页

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein... 【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。 展开更多

关键词 酵母双杂交 流感病毒 PA蛋白 PCBP1蛋白 蛋白互作

下载PDF 职称材料

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达 被引量：2

17

作者 周财源 张名岳 +3 位作者 韩宗玺 邵昱昊 刘胜旺 马得莹 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期999-1009,共11页

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分... 【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。 展开更多

关键词 鹅AvBD10 克隆 遗传进化分析 组织表达 抗菌活性

下载PDF 职称材料

鸭β-防御素16的分离、鉴定及其抗病毒机制 被引量：1

18

作者 张可心 张名岳 +4 位作者 辛胜男 韩宗玺 邵昱昊 刘胜旺 马得莹 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第18期3873-3882,共10页

【研究目的】旨在克隆与表达鸭β-防御素16(AvBD16)基因及测定其生物学特性,监测了鸭肝炎病毒感染后麻鸭不同组织AvBD16与TLR-7的动态变化。【方法】采用RT-PCR方法,从鸭骨髓组织中扩增到鸭AvBD16,并将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-... 【研究目的】旨在克隆与表达鸭β-防御素16(AvBD16)基因及测定其生物学特性,监测了鸭肝炎病毒感染后麻鸭不同组织AvBD16与TLR-7的动态变化。【方法】采用RT-PCR方法,从鸭骨髓组织中扩增到鸭AvBD16,并将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对其重组和合成蛋白进行生物学活性测定。采用荧光定量PCR方法,分别检测了鸭肝炎病毒对鸭AvBD16和TLR-7在不同组织中表达量的影响。【结果】鸭AvBD16 cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性最高,为62%。重组和合成鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响,且溶血活性极低。重组AvBD16蛋白具有体外抗病毒活性。经鸭肝炎病毒诱导后,鸭AvBD16在肝脏及其他组织中被诱导表达或表达量显著上调,且与TLR7的表达量呈正相关。【结论】成功克隆并表达了鸭AvBD16基因,重组和合成AvBD16蛋白具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。重组AvBD16蛋白具有抗鸭肝炎病毒的活性,体内抗病毒作用可能受TLR-7通路调节。 展开更多

关键词 鸭AvBD16 抗菌活性 抗病毒活性 信号传导

下载PDF 职称材料

猪圆环病毒2型衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：3

19

作者 姚永红 崔然 +3 位作者 赵钦 王刚 肖一红 周恩民 《山东农业科学》 2012年第9期9-12,21,共5页

为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检... 为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检测两株单克隆抗体识别的抗原表位关系。SDS-PAGE和Western blot结果表明重组蛋白ORF2得到高效表达;筛选获得两株稳定分泌抗ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3H3和3F2,其分泌的单体均为IgG1亚型;且均具有较高的特异性和敏感性;叠加ELISA显示,两株单克隆抗体识别不同的抗原表位。本研究制备的单抗有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速准确诊断方法的建立提供了平台。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 ORF2蛋白 单克隆抗体

下载PDF 职称材料

马传染性贫血病毒疫苗株S2基因不同变异位点逆向突变感染性克隆的体外复制特性分析

20

作者 高旭 姜成刚 +4 位作者 高华 林跃智 赵立平 相文华 周建华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期919-924,共6页

为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAVFDDV15)S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDV15感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向... 为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAVFDDV15)S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDV15感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向突变为强毒株相应氨基酸的6株感染性克隆衍生毒株。经实时定量PCR、逆转录酶活性和western blot等检测表明,疫苗株S2基因4个稳定性变异位点全部逆向突变的感染性克隆衍生毒vpFDDVS2r1-3-4-5在体外培养靶细胞中的复制水平低于亲本疫苗株感染性克隆衍生病毒和其他组合的逆向突变的感染性克隆衍生病毒,提示EIAV疫苗株S2蛋白4个稳定突变位点的综合作用可能是决定疫苗株和强毒株特性差异的因素之一。以上结果为体内感染S2基因逆向突变感染性克隆衍生病毒,进一步揭示S2基因在EIAV弱毒疫苗致弱过程中的作用提供了依据。 展开更多

关键词 马传染性贫血病毒 S2基因 逆向突变 感染性克隆 复制特性

下载PDF 职称材料