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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
1
作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究 被引量：2
2
作者 周仕君 宋洁 +3 位作者 李帅 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期423-428,共6页
为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mch... 为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mcherry-MGF505-7R,采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA(sgRNA),并克隆至pX330载体中,构建重组质粒pX330-sgH240R和pX330-sgMGF505-7R,经测序鉴定正确后,将线性化的同源臂质粒pBS-GFP-H240R与pX330-sgH240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM),再以ASFV感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R;采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R;在ASFV-ΔH240R的基础上,将线性化的同源臂质粒pBS-Mcherry-MGF505-7R与pX330-sgMGF505-7R共转染PAM后,再以ASFV-ΔH240R感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建双基因缺失病毒ASFV-ΔH240R-Δ7R。上述3株基因缺失病毒均采用PCR和测序鉴定正确后,均以MOI 1感染PAM,24 h后于荧光显微镜观察;同时采用红细胞吸附试验测定不同培养时间的病毒载量即半数红细胞吸附量(HAD50),并绘制各病毒的生长曲线。结果显示,ASFV-ΔH240R、ASFV-Δ7R及ASFV-ΔH240R-Δ7R感染的PAM分别出现绿色荧光、红色荧光及红绿色双色荧光,而ASFV-WT感染的细胞无荧光,表明正确构建各基因缺失病毒。生长曲线测定结果显示,ASFV-Δ7R和亲本病毒生长曲线基本一致,ASFV-ΔH240R复制水平显著低于亲本病毒(P<0.001),ASFV-ΔH240R-Δ7R复制水平显著高于ASFV-ΔH240R(P<0.01),但仍低于亲本株。表明MGF505-7R基因与病毒的复制无关,但H240R基因与病毒的复制有关,在ASFV-ΔH240R的基础上缺失MGF505-7R基因则可部分恢复病毒的复制能力。本研究构建了3株基因缺失ASFV并测定其生长曲线,为进一步研究ASFV基因功能提供了数据参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 H240R MGF5050-7R 基因缺失病毒
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