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优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因 被引量：9
1
作者 梁成真 张锐 +4 位作者 孙国清 孟志刚 周焘 丁忠涛 郭三堆 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2010年第3期195-201,共7页
ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明... ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。 展开更多
关键词 棉花 ABF/AREB/ABI5/DPBF 转录因子 TAIL-PCR 抗逆相关基因
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枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达 被引量：6
2
作者 白玮 张锐 郭三堆 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期876-883,共8页
【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步... 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69kD,表达水平29.77mg·L-1,水解酪素酶活力27800U·g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶 抗菌活性 毕赤酵母表达
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实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立 被引量：4
3
作者 闫喜中 张锐 +3 位作者 孟志刚 孙国清 周涛 郭三堆 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第26期11376-11377,共2页
[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因... [目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。 展开更多
关键词 晚基因 实时荧光定量PCR 标准曲线
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拟南芥尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)基因启动子的分离及表达特性分析 被引量：6
4
作者 朱永兴 王磊 +2 位作者 张兰 张伟 范云六 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期554-559,共6页
尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)是催化生育酚生物合成分支途径中的关键酶,催化叶绿醇焦磷酸(phytyl-PP)与尿黑酸(HGA)缩合生成生育酚的前体。本研究从拟南芥中分离HPT基因的启动子序列946bp,构建了该启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介... 尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)是催化生育酚生物合成分支途径中的关键酶,催化叶绿醇焦磷酸(phytyl-PP)与尿黑酸(HGA)缩合生成生育酚的前体。本研究从拟南芥中分离HPT基因的启动子序列946bp,构建了该启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,取正常生长条件下的拟南芥转基因植株进行GUS组织化学染色,结果表明,在HPT启动子的驱动下,GUS基因主要在转基因拟南芥的根中高表达,在成熟叶片、花丝、雌蕊中也有一些表达,而在茎、根尖、花药、种荚及发育的种子中则未表达,可见该启动子为根优势表达启动子。 展开更多
关键词 拟南芥 维生素E 生育酚 尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT) 启动子
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植物微小RNA(microRNA)研究进展 被引量：16
5
作者 王磊 范云六 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2007年第3期18-23,共6页
真核细胞中存在大量的非编码RNA,～22nt的小RNA是其中一类非常重要的调控RNA,主要包括siRNA和miRNA两种类型,二者均由类似RNaseⅢ的核酸内切酶-Dicer加工产生,随后进入沉默复合体抑制靶基因表达。miRNA分子与siRNA类似,但miRNA的前体在... 真核细胞中存在大量的非编码RNA,～22nt的小RNA是其中一类非常重要的调控RNA,主要包括siRNA和miRNA两种类型,二者均由类似RNaseⅢ的核酸内切酶-Dicer加工产生,随后进入沉默复合体抑制靶基因表达。miRNA分子与siRNA类似,但miRNA的前体在基因组上具有独立的转录单位,可自身折叠成发卡结构,其靶基因主要是与器官发生及生长发育相关的转录因子以及调控蛋白。miRNA在生物生长发育的各个时期都扮演着重要的角色,调控许多重要的生物途径,处于基因调控网络的核心位置。 展开更多
关键词 小RNA 干扰小RNA(siRNA) 微小RNA(miRNA) 发育
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大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析 被引量：4
6
作者 张兰 王晓萍 +3 位作者 毕影东 张春义 范云六 王磊 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第21期2604-2611,共8页
WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族,它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应,还参与了生长发育及多种代谢途径的调控.本研究构建了一个大豆cDNA文库,采用酵母单杂交的方法,用来自AtNPR1启动子区的W-box对构... WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族,它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应,还参与了生长发育及多种代谢途径的调控.本研究构建了一个大豆cDNA文库,采用酵母单杂交的方法,用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选,获得了GmWRKY57B基因,该基因全长1033bp,编码299个氨基酸,属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组;酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明,GmWRKY57B能够与W-box特异性结合;酵母体内的转录激活实验表明,GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能;GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达;GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性,表明GmWRKY57B基因在非生物逆境中有一定的功能. 展开更多
关键词 大豆 WRKY 转录因子 W—box 转基因 抗旱性
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陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建 被引量：2
7
作者 周焘 郭红媛 +3 位作者 张锐 梁成真 石雅丽 郭三堆 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期252-254,共3页
18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体(BAC)文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明,BAC文库DNA插... 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体(BAC)文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明,BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。 展开更多
关键词 棉花 18R 雄性不育恢复系 细菌人工染色体文库
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