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题名线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建
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作者
何群
林子清
张玉魁
王天胶
潘忠诚
赵雨杰
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机构
中国医科大学生物芯片中心/教育部细胞生物学重点实验室
中国刑事警察学院法医系
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出处
《中国医药生物技术》
CSCD
2009年第2期96-101,共6页
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基金
国家科技支撑计划(2007BAK26B04)
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文摘
目的构建用于线粒体DNA(mtDNA)D-环控制区(D-LOOP区)多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D-LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N’-对羧苄基吲哚三菁(Cy5)标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D-LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D-LOOP区片段(466bp)与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0.1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基"C"的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D-LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。
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关键词
寡核苷酸序列分析
DNA
线粒体
多态性
单核苷酸
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Keywords
Oligonucleotide array sequence analysis
DNA, mitochondrial
Polymorphism, single nucleotide
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分类号
D919
[医药卫生—法医学]
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