留学生医学微生物学教学心得体会 被引量：9

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作者 黄俊琪 《热带医学杂志》 CAS 2003年第4期495-497,共3页

本文阐述留学生在医学微生物学学习过程中存在的语言和学习方法等普遍问题,从教学实践中探索解决这些影响学习的问题和探索提高他们学习效果的方法。

关键词 留学生 医学微生物学 教学体会

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DEN2重组E蛋白单克隆抗体的制备及其生物学活性 被引量：2

2

作者 曾祥凤 江丽芳 +3 位作者 方丹云 汤云霞 魏惠永 晏辉钧 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期56-60,共5页

[目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫... [目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的McAbs,用ELISA、IFA、Western Blot和空斑减数中和实验等鉴定McAbs的各种生物学活性.[结果]用ELISA、IFA检测证实5株杂交瘤细胞产生的McAbs与DEN2重组E蛋白和DEN全病毒均有较高的亲和力;Western Blot分析发现其中3株杂交瘤细胞(3G3,6G11,4E3)分泌的McAbs能与其相对分子质量Mr=(66～69)×103的DEN2重组E蛋白结合.空斑减数中和实验证实所获得的单克隆抗体具有中和登革病毒感染C6/36细胞的作用.[结论]成功地制备了5株抗登革病毒E蛋白特异性的McAbs,为进一步研究E蛋白的结构和功能及临床诊断试剂盒研发打下了基础. 展开更多

关键词 E蛋白 DEN 单克隆抗体 生物学活性 登革病毒 ELISA 分泌 杂交瘤细胞 硫酸铵沉淀法 纯化

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常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨 被引量：4

3

作者 洪帮兴 江丽芳 +3 位作者 胡玉山 方丹云 陶剑平 晏辉钧 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期151-155,共5页

【目的】探讨运用聚合酶链反应邛艮制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性。【方法】选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因,通过设计合适的通... 【目的】探讨运用聚合酶链反应邛艮制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性。【方法】选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增,并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析。【结果】运用通用引物可以扩增出13 属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因HpaⅡ酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱,利于进行细菌属的鉴定。不同种属食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大,不利于进行种属间鉴别。对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明,不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP图谱的变异性较大,这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别。【结论】PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力。 展开更多

关键词 23S RDNA 限制性片段长度多态性 单链构象多态性 聚合酶链反应 食源性感染

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登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定 被引量：2

4

作者 晏辉钧 江丽芳 +2 位作者 方丹云 周经姣 郭辉玉 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期482-484,488,共4页

目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒... 目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌诱导表达,SDSPAGE检测表达产物。结果RTPCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut+酵母转化菌可分泌表达Mr约78000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质。结论成功将克隆的全长DEN2NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性。 展开更多

关键词 登革2型病毒 NS3基因 巴氏毕赤酵母 基因表达 抗体

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SARS冠状病毒S2基因原核表达及免疫学特性 被引量：3

5

作者 周浩 龙北国 +4 位作者 张文炳 江丽芳 陈丽丹 贡树基 赵卫 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期962-964,共3页

目的研究严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒S2蛋白表达并对其免疫学特性。方法克隆SARS冠状病毒S2基因,并在大肠埃希菌中表达谷胱甘肽硫转移酶(GST-S2)融合蛋白。通过免疫印迹(Westernblot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定表达GST... 目的研究严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒S2蛋白表达并对其免疫学特性。方法克隆SARS冠状病毒S2基因,并在大肠埃希菌中表达谷胱甘肽硫转移酶(GST-S2)融合蛋白。通过免疫印迹(Westernblot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定表达GST-S2融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的GST-S2融合蛋白可与谷胱甘肽硫转移酶(GST)多克隆抗体结合,并在85千道尔顿(KD)处出现特异性结合条带。GST-S2蛋白能与SARS患者恢复期血清反应,而不与正常人血清反应。结论本项研究获得了SARS冠状病毒GST-S2融合蛋白,它可与GST多克隆抗体特异性结合,并与SARS患者恢复期血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 S2基因 克隆

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SARS病例尸解标本和咽嗽液中病原体检测 被引量：2

6

作者 晏辉钧 赵卫 +5 位作者 方丹云 周经姣 张文炳 龙北国 郭辉玉 江丽芳 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期513-515,共3页

目的　确定严重急性呼吸系统综合征(SARS)病例尸解肺组织和咽嗽液中病原体种类。方法　用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本,用RT- PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特... 目的　确定严重急性呼吸系统综合征(SARS)病例尸解肺组织和咽嗽液中病原体种类。方法　用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本,用RT- PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特异核酸片段,并进行序列测定。结果　在死亡病人肺组织中观察到衣原体的网状体、中间体以及原体颗粒,并见衣原体包涵体样结构;用RT- PCR法在2例尸解肺组织扩增出预期大小的DNA片段,测序后经相似性(BLAST)比较,其与SARS冠状病毒相应基因片段高度同源;用巢式RT -PCR技术在SARS病人咽漱液中扩增出SARS冠状病毒特异基因片段。结论　在SARS尸解肺组织中发现衣原体样颗粒,在尸解肺组织和咽漱液中扩增出SARS冠状病毒核酸片段,说明SARS患者可合并衣原体等微生物混合感染。 展开更多

关键词 传染性非典型肺炎 衣原体 SARS冠状病毒 电镜 逆转录多聚酶链式反应

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SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究 被引量：1

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作者 晏辉钧 赵卫 +5 位作者 方丹云 周经姣 龙北国 张文炳 郭辉玉 江丽芳 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期38-41,共4页

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GS... 【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 表达 GST融合蛋白 融合蛋白 恢复期 免疫学特性 血清 大肠杆菌 特异性结合 克隆

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铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达重组质粒的构建 被引量：1

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作者 朱家馨 陈瑞 +3 位作者 周宇麒 黄静 张天托 江丽芳 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2006年第3期174-175,178,共3页

目的扩增铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因,导入载体pMD18-T和pGEX-4T-1构建重组质粒pMD18-T/VIM-2和pGEX-4T-1/VIM-2。方法采用PCR技术从铜绿假单胞菌扩增VIM-2基因,先将其亚克隆入pMD18-T载体后测定核苷酸序列。再将VIM-2基因... 目的扩增铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因,导入载体pMD18-T和pGEX-4T-1构建重组质粒pMD18-T/VIM-2和pGEX-4T-1/VIM-2。方法采用PCR技术从铜绿假单胞菌扩增VIM-2基因,先将其亚克隆入pMD18-T载体后测定核苷酸序列。再将VIM-2基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠埃希菌JM109。用限制性酶切分析、PCR、序列分析等进行重组质粒鉴定。结果扩增出801 bp的VIM-2基因,构建重组质粒pMD18-T/VIM-2和pGEX-4T-1/VIM-2。结论成功扩增801 bp的VIM-2基因,该基因与国外同类酶的核苷酸同源性100%。重组质粒pGEX-4T-1/VIM-2构建成功。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 金属Β-内酰胺酶 VIM-2 PCR

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登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

9

作者 曾祥凤 江丽芳 +2 位作者 邵焰 方丹云 魏惠永 《热带医学杂志》 CAS 2004年第6期662-665,共4页

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因,构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS1基因序列,并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ/XbalⅠ位点,构建真核表达载体pPICZαB-NS1,转化E.coliDH5a菌。阳性重组质粒用... 目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因,构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS1基因序列,并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ/XbalⅠ位点,构建真核表达载体pPICZαB-NS1,转化E.coliDH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ/XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因;序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99%同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体pPICZαB-NS1,为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 登革病毒 NS1基因 克隆 测序 真核表达

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检测SARS冠状病毒的套式RT-PCR方法的建立与初步应用

10

作者 赵卫 晏辉钧 +5 位作者 张文炳 方丹云 周经姣 朱利 江丽芳 龙北国 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2007年第3期455-456,459,共3页

[目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒(SARS-CoV)组织培养上清中提取RNA,利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物,进行逆转录及套式PCR... [目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒(SARS-CoV)组织培养上清中提取RNA,利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物,进行逆转录及套式PCR扩增。扩增出的阳性片段连接入pGEM-T载体中,测序后比较其与其他已知SARS冠状病毒的同源性。[结果]从SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及SARS冠状病毒组织培养上清中均可扩增出阳性片段,经测序后证实是SARS冠状病毒特有序列。[结论]针对SARS冠状病毒多聚酶基因所建立的套式RT-PCR方法适用于临床标本及组织培养标本中SARS冠状病毒的检测。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 套式RT-PCR 检测

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SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

11

作者 晏辉钧 赵卫 +5 位作者 方丹云 周经姣 龙北国 张文炳 郭辉玉 江丽芳 《中国病毒学》 CSCD 2005年第1期1-4,共4页

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取 RNA,进行 RT PCR扩增其 M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB,电穿孔法将重组体整合入酵母菌 P. pastoris,经抗生素 Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌用甲醇诱导表达,SD... 从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取 RNA,进行 RT PCR扩增其 M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB,电穿孔法将重组体整合入酵母菌 P. pastoris,经抗生素 Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌用甲醇诱导表达,SDS PAGE检测其表达产物。Mut+ 酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约 65kDa和42 kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 M基因 克隆 巴氏毕赤酵母 表达

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登革病毒Ⅱ(NGC株)pET-42a-NS_(4b)-NS_5载体构建

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作者 谢水祥 晏辉钧 江丽芳 《赣南医学院学报》 2005年第5期583-585,共3页

目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得... 目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得了一个长为1.05Kb的基因片段。结论:成功构建了含有DEN2全长NS4b-NS5基因的原核表达载体pET42a-NS4b-NS5。 展开更多

关键词 登革病毒 pET42a-NS4b-NS5 基因

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