猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

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作者 王海燕 张珍珍 +2 位作者 倪博 刘蓓蓓 冯志新 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期216-226,共11页

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道... 【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白,被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手,分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用,揭示Mhp引起炎性损伤的新机制,为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cells,PBECs)感染模型和猪体感染模型,通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法,分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定,构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时,设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭,通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中,通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因,后感染Mhp,利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法,明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变,主要组织病理表现为肺脏炎性损伤,同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后,体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明,Mhp可诱导肺脏炎性反应,抑制SPLUNC1表达。另一方面,体外PBECs中过表达SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少;siRNA干扰SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加,表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程,本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明:无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育,还是SPLUNC1抗体体内封闭,Mhp的体内外生长均未受影响;SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响;过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活,相反SPLUNC1 siRNA干扰后,可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附,而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达,维护宿主炎性平衡;与此同时,Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控,进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 支原体-宿主相互作用 炎性反应 SPLUNC1

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基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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作者 白昀 谢青云 +6 位作者 欧阳伟 甘源 袁厅 赵东明 步志高 邵国青 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期300-310,共11页

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

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绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

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作者 杜改梅 王月 +3 位作者 茅慧华 雷卫强 储岳峰 刘茂军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1728-1737,共10页

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μ... 旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 小鼠 感染模型

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新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

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作者 毕振威 王文杰 +1 位作者 刘雅坤 彭大新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期660-669,共10页

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及... 物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。 展开更多

关键词 A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32A(caANP32A) RNA聚合酶活性 哺乳动物适应性

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关于我国种猪场猪肺炎支原体净化的思考

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作者 冯志新 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第3期154-156,共3页

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪... 猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪肺炎支原体净化方案的经验与我国生猪养殖特殊性的分析,提出分群体、分阶段的“三步法”净化建议,并对我国猪肺炎支原体的净化提出了展望。 展开更多

关键词 种猪场 猪肺炎支原体 净化

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猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

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作者 黄媛媛 王佳 +6 位作者 陈嘉瑜 甘源 袁厅 冯志新 邵国青 王先炜 熊祺琰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1249-1256,共8页

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学... 本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。 展开更多

关键词 腹膜间皮细胞 原代培养 猪 猪鼻支原体

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新城疫病毒La Sota株热损伤靶点的初步分析

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作者 曾敏倩 焦嘉杰 +7 位作者 左晓昕 王军宁 赵艳红 冯磊 卢宇 吕芳 周斌 侯继波 《中国家禽》 北大核心 2024年第2期59-67,共9页

为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加... 为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加热24 h后F蛋白活性首先受损,表现为内化功能显著下降(0.01<P<0.05),56℃加热15 min后HN和F蛋白活性几乎丧失,表现为吸附及内化功能均极显著下降(P<0.01);高温加热后,病毒核衣壳完整性显著降低,病毒粒子破损且失去纤突结构,表现为吸附及内化功能极显著下降(P<0.01)。研究表明,La Sota株热损伤靶点与加热温度和时间密切相关:中温下(≤56℃)病毒热损伤靶点主要在HN和F蛋白,高温下(≥80℃)病毒热损伤靶点为纤突蛋白和核衣壳;纤突蛋白的热敏感性高于核衣壳,且F蛋白受损早于HN蛋白。 展开更多

关键词 新城疫病毒 La Sota株 热损伤靶点 吸附 内化 纤突蛋白 核衣壳

原文传递

雾化疫苗研究进展

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作者 吴伟 郝飞 +1 位作者 谢星 冯志新 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1203-1213,共11页

近年来,随着黏膜疫苗及免疫技术的不断发展,针对呼吸道疾病免疫预防的雾化疫苗及相应雾化吸入免疫技术的报道与应用逐渐增多。雾化疫苗是通过雾化装置将液态和固态免疫原制成雾滴或气溶胶颗粒,以喷雾免疫或气溶胶免疫的形式进入人与动... 近年来,随着黏膜疫苗及免疫技术的不断发展,针对呼吸道疾病免疫预防的雾化疫苗及相应雾化吸入免疫技术的报道与应用逐渐增多。雾化疫苗是通过雾化装置将液态和固态免疫原制成雾滴或气溶胶颗粒,以喷雾免疫或气溶胶免疫的形式进入人与动物呼吸道及肺部,并诱导机体产生保护性应答的疫苗。雾化免疫能更好地诱导黏膜免疫应答,同时避免了注射带来的疾病传播风险和疼痛。20世纪50年代鸡新城疫疫苗的喷雾免疫研究拉开了动物呼吸道免疫的序幕,随后开展了鸡传染性支气管炎疫苗的喷雾接种,目前很多禽用疫苗的喷雾免疫已被广泛使用。猪用疫苗的气溶胶免疫研究起步较晚,难度也更大。20世纪70年代末以来,逐步在猪瘟疫苗、猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗及猪支原体肺炎疫苗上开展相应的气溶胶免疫研究。相比动物疫苗,人用疫苗的气溶胶免疫研究报道更多,主要集中在麻疹疫苗、结核疫苗和流感疫苗。2019年以来,新型冠状病毒肺炎疫苗的气溶胶免疫快速发展,目前在中国已被批准紧急使用。笔者就动物用及人用雾化疫苗研究现状进行系统陈述,总结分析了各类雾化疫苗的理化参数、安全性、体内趋向性、肺脏局部免疫应答、免疫接种效果,并提出未来在疫苗剂型与组份、雾化发生装置、雾化过程质控、免疫程序与效果评价等方面的研究需求。本综述可为后续相应的呼吸道黏膜疫苗研发提供参考。 展开更多

关键词 雾化疫苗 气溶胶 群体免疫 传染病防控

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不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

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作者 刘镝钺 程子龙 +8 位作者 陈益 陈思宇 李文良 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 熊富强 刘茂军 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第4期72-77,共6页

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 BALB/C小鼠 致病性 基因型

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W/O/W佐剂添加两种免疫增强剂对口蹄疫灭活疫苗的影响

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作者 周宇杰 卢宇 +3 位作者 许泽玉 唐健中 钱莺娟 邓碧华 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期300-307,共8页

为进一步提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果,本研究在水包油包水(W/O/W)佐剂配方上添加免疫增强剂,一种是天然化合物维生素E(VE),另一种是人工合成的咪喹莫特衍生物(IMQ-Chol)。每种免疫增强剂设低中高三种不同剂量,加入到基础配方中制备成... 为进一步提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果,本研究在水包油包水(W/O/W)佐剂配方上添加免疫增强剂,一种是天然化合物维生素E(VE),另一种是人工合成的咪喹莫特衍生物(IMQ-Chol)。每种免疫增强剂设低中高三种不同剂量,加入到基础配方中制备成不同的佐剂,然后与口蹄疫灭活病毒进行配伍。观察各组疫苗的外观并检测其稳定性、黏度、粒径和多分散系数(PDI)以确定其理化性质;称量小鼠体重、检测血常规、血液生化和组织学变化来评估免疫增强剂的安全性;检测小鼠血清中的特异性抗体、抗体亚型、细胞因子水平以及小鼠脾T淋巴细胞的分化情况,评价免疫增强剂对疫苗免疫效果的影响。结果显示,配制的疫苗均为乳白色W/O/W乳液,37℃放置9周疫苗未出现分层现象,黏度均在16 cp以下,粒径在270 nm~370 nm之间,PDI在0.34~0.42之间;不同剂量的免疫增强剂对小鼠体重没有影响(P>0.05),血常规、血液生化及组织学切片结果表明两种免疫增强剂的生物安全性良好;添加VE或IMQ-Chol的免疫组与基础配方免疫组相比,特异性抗体水平均显著提高(P<0.01);其中,添加高剂量VE的免疫组和添加低剂量IMQ-Cho的免疫组不仅特异性抗体水平显著提高(P<0.001),Th1型相关分子(Ig G2a、IFN-γ、IL-12)和Th2型相关分子(Ig G1、IL-4、IL-6)的分泌水平也有提升(P<0.05);这两组的CD3^(+)CD4^(+)T细胞的比例分别为75.2%和77.3%,高于基础配方组的69.6%,且CD4^(+)/CD8^(+)比值也高于基础配方组(P<0.05)。以上结果表明,VE和IMQ-Chol这两种免疫增强剂在不影响疫苗的理化特性的同时都具有良好的安全性,并且添加高剂量的VE或低剂量的IMQ-Chol更能有效地提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果。 展开更多

关键词 口蹄疫 W/O/W佐剂 免疫增强剂 维生素E 咪喹莫特

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猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定

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作者 谢青云 邢蕙萱 +4 位作者 于岩飞 袁厅 熊祺琰 熊富强 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期271-281,共11页

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗... 猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 解旋酶RuvA DNA结合 多克隆抗体

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鸟苷酸结合蛋白GBP1和GBP2抑制猪轮状病毒体外复制

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作者 陈姝宇 朱雪蛟 +5 位作者 周金柱 陶然 张雪寒 索朗斯珠 贡嘎 李彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期245-257,共13页

本研究旨在探究鸟苷酸结合蛋白1(guanylate-binding protein-1,GBP1)、鸟苷酸结合蛋白2(guanylate-binding protein-2,GBP2)的全长、片段、GTPase酶活性对猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)复制的影响。以猪肾细胞cDNA和GBP1、GBP2质... 本研究旨在探究鸟苷酸结合蛋白1(guanylate-binding protein-1,GBP1)、鸟苷酸结合蛋白2(guanylate-binding protein-2,GBP2)的全长、片段、GTPase酶活性对猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)复制的影响。以猪肾细胞cDNA和GBP1、GBP2质粒为模板,PCR扩增出GBP1、GBP 2基因的全长和截断体(G、M、E、ME区),克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体上。在恒河猴细胞(MA104)细胞上过表达或沉默GBP1、GBP 2基因,探究对PoRV复制的影响。设置不同的时间点,筛选GBP1、GBP2对PoRV复制产生影响作用的时间点。应用泛GTPase酶抑制剂(CID-1067700)探究GBP1、GBP2的GTPase酶活性对PoRV的作用。通过免疫印迹法Western blot、荧光定量PCR、病毒毒价测定等方法检测GBP1、GBP2蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果表明:成功构建pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2(47aa-592aa)、(131aa-592aa)-HIS重组质粒,经验证能够表达。PoRV在蛋白和mRNA水平上能显著促进GBP1、GBP2基因表达上调。过表达GBP1、GBP2基因能显著抑制PoRV复制,沉默GBP1、GBP2基因的表达能显著促进PoRV复制。成功构建并表达了GBP1、GBP2蛋白的G、M、E、ME结构域截断体。过表达截断体基因发现GBP1、GBP2的G区域抑制PoRV的复制。通过泛GTPase抑制酶活性,发现GBP1、GBP2抑制PoRV复制需要依赖GTPase酶活性。GBP1、GBP2蛋白能够抑制PoRV的复制,该抑制作用依赖GBP蛋白GTPase酶活性区域。研究结果为PoRV寻找新的药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。 展开更多

关键词 猪轮状病毒 GBP1 GBP2 抗病毒 结构域

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猪支原体肺炎活疫苗与灭活疫苗联合免疫效果评价 被引量：1

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作者 郝飞 白昀 +8 位作者 袁厅 张磊 刘蓓蓓 谢星 韦艳娜 甘源 熊祺琰 邵国青 冯志新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期89-95,共7页

为探寻一种更加合理高效的猪支原体肺炎(MPS)免疫方式,本研究使用MPS弱毒疫苗进行基础免疫后14 d再使用灭活疫苗进行加强免疫,通过人工感染猪肺炎支原体来评价其免疫效果。同时将这种免疫程序在规模化猪场进行应用,通过计算一定时期内... 为探寻一种更加合理高效的猪支原体肺炎(MPS)免疫方式,本研究使用MPS弱毒疫苗进行基础免疫后14 d再使用灭活疫苗进行加强免疫,通过人工感染猪肺炎支原体来评价其免疫效果。同时将这种免疫程序在规模化猪场进行应用,通过计算一定时期内的日增重来评价其免疫效果。结果显示:联合免疫在保证黏膜免疫效果的同时并未降低体液免疫水平;更为重要的是,联合免疫不但具备较高攻毒保护率,而且在攻毒后剖杀时其肺泡灌洗液中抗原含量远低于其他免疫方式。以上结果表明,联合免疫可以产生较好的免疫协同作用,从而提高了机体的综合免疫保护能力。田间试验结果发现:联合免疫组猪群从21日龄至80日龄平均增重27.31 kg,比活疫苗免疫组猪群多增重3.02 kg,比灭活疫苗免疫组猪群多增重3.73 kg;其平均日增重可达0.46 kg/d。本研究为防治猪支原体肺炎提供了新的思路。 展开更多

关键词 猪支原体肺炎活疫苗和灭活疫苗 初免-加强免疫策略 攻毒保护 日增重

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猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

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作者 杨利 张浩明 +2 位作者 于晓明 侯立婷 郑其升 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期822-828,共7页

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条... 为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40960,是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%~4.49%和1.90%~8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV IgA抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其免疫背景相符。本研究为PEDV感染猪初乳的检测及PED疫苗免疫效力的评价提供了一种新的技术手段。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 IgA检测 捕获ELISA 猪初乳

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靶向B细胞的口蹄疫GHloop多肽抗原的制备及免疫效力鉴定

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作者 侯立婷 张媛媛 +7 位作者 于晓明 杜露平 张元鹏 程海卫 乔绪稳 李丁 郑其升 陈瑾 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期74-81,共8页

本研究将葡萄球菌A蛋白人工合成类似物的二聚体(DD)与口蹄疫的GHloop串联,按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成GHloop-DD,并评价其免疫原性。将GHloop-DD插入到原核表达载体pET-32a中,鉴定阳性后转入E.coli BL21进行诱导表达。利用SDS-PAG... 本研究将葡萄球菌A蛋白人工合成类似物的二聚体(DD)与口蹄疫的GHloop串联,按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成GHloop-DD,并评价其免疫原性。将GHloop-DD插入到原核表达载体pET-32a中,鉴定阳性后转入E.coli BL21进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blot对目的基因表达产物的可溶性进行分析。利用镍亲和层析柱纯化目的蛋白;利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度,将重组蛋白(2.5μg/只)与206佐剂乳化,制备疫苗,免疫5周龄小鼠,同时设商品化合成肽苗对照与空白对照。免疫后28 d采集试验小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平;利用流式细胞仪测定淋巴结B细胞的数量及骨髓中长寿浆细胞的数量;利用荧光定量检测相关趋化因子的表达水平;利用细胞因子检测试剂盒检测脾脏淋巴细胞刺激后上清液中的细胞因子的水平。SDS-PAGE结果表明,GHloop-DD基因在大肠杆菌中以可溶形式获得高水平表达;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能够与特异性抗体发生反应。免疫试验结果表明,GHloop-DD不但能够刺激免疫小鼠产生高水平的多肽特异性ELISA抗体,而且能够提高淋巴结B细胞的数目及相关趋化因子水平,使骨髓中长寿浆细胞的数量和脾脏淋巴细胞刺激后上清液中细胞因子的水平显著提高。以上结果表明,本研究制备的GHloop-DD具有良好的免疫原性,为口蹄疫多肽疫苗的研制提供了新的方向。 展开更多

关键词 GHloop-DD 体液免疫 B细胞 长寿浆细胞

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CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌表达

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作者 张元鹏 侯立婷 +10 位作者 杜露平 于晓明 李兰 杨利 张浩明 王义伟 乔绪稳 程海卫 秦竹 陈瑾 郑其升 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第9期42-46,共5页

有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将... 有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将重组载体转化到枯草芽胞杆菌WB600中,用IPTG诱导重组菌表达,发酵液离心后取上清液,通过SDS-PAGE和Western blot方法分析蛋白表达情况。发酵上清液经Ni-IDA琼脂糖树脂纯化,与流感病毒HA抗原混合后共同滴鼻免疫小鼠后采集小鼠血清和支气管肺泡灌洗液检测IgG和IgA的抗体水平。结果显示:重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中能够分泌表达,在发酵罐中发酵36 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小在42 kDa左右,蛋白产量最高能到700μg/mL,Western blot检测目的蛋白正确表达。重组蛋白经过Ni-IDA琼脂亲和层析纯化后与HA抗原混和滴鼻免疫小鼠,ELISA结果显示CTA1-DD蛋白组针对HA抗原能够诱导更高的血清IgG和黏膜IgA抗体水平,说明枯草芽胞杆菌表达的CTA1-DD蛋白具有佐剂活性。试验结果为进一步研究CTA1-DD蛋白在黏膜佐剂的大规模生产应用奠定了基础。 展开更多

关键词 CTA1-DD蛋白 枯草芽胞杆菌 表达 黏膜免疫

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适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立 被引量：2

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作者 谢青云 易玮婕 +9 位作者 李嘉豪 白昀 谢星 袁厅 张越 冯余凡 赵东明 步志高 刘斐 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4311-4319,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的AS... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 sIgA抗体 量子点免疫试纸条 现场即时检验

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鉴别检测兔出血症病毒1型、2型双抗体夹心ELISA方法的建立及应用 被引量：1

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作者 陈兴继 魏后军 +6 位作者 范志宇 胡波 宋艳华 陈萌萌 仇汝龙 葛雷 王芳 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第24期161-167,共7页

为实现对兔出血症病毒1型(RHDV1)和兔出血症病毒2型(RHDV2)的有效鉴别诊断,从而有效预防和控制兔出血症,将抗RHDV广谱单抗2A11作为捕获抗体包被于ELISA板,以HRP标记的抗RHDV1特异性单抗1D4、抗RHDV2特异性单抗6B3分别作为检测抗体,经条... 为实现对兔出血症病毒1型(RHDV1)和兔出血症病毒2型(RHDV2)的有效鉴别诊断,从而有效预防和控制兔出血症,将抗RHDV广谱单抗2A11作为捕获抗体包被于ELISA板,以HRP标记的抗RHDV1特异性单抗1D4、抗RHDV2特异性单抗6B3分别作为检测抗体,经条件优化,建立了鉴别检测兔出血症病毒1型、2型的双抗体夹心ELISA方法,并进行敏感性、特异性试验,对送检的60份兔肝脏样品用该双抗体夹心ELISA方法和RT-PCR方法进行检测,比较这2种方法的符合率。结果显示,该双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:捕获抗体浓度为4μg/mL,2种HRP标记的检测抗体的浓度均为0.5μg/mL;判定标准为:以检测抗体HRP-1D4检测样品D值>0.195判为RHDV1阳性,以检测抗体HRP-6B3检测样品D值>0.166判为RHDV2阳性;通过特异性和敏感性试验发现,该双抗体夹心ELISA方法具有较强特异性和较高敏感性。检测60份送检的兔肝脏样品,发现本方法与RT-PCR方法相比,检测RHDV1阳性样品的符合率为100%(9/9),RHDV2阳性样品的符合率为82.61%(19/23),阴性样品的符合率为87.5%(28/32),总符合率为93.33%(56/60),且该方法阳性样品检出率高于RT-PCR方法。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可有效地鉴别检测RHDV1和RHDV2这2种不同基因型的病毒,为兔出血症的流行病学研究提供有力的技术支撑。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 双抗体夹心ELISA 单抗 鉴别检测

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羊腹泻样本中大肠杆菌的分离、毒力基因与耐药性分析

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作者 刘鑫欢 恽佳蕾 +11 位作者 毛立 李基棕 郝飞 何苗锋 杨蕾蕾 张纹纹 程子龙 孙敏 刘茂军 王少辉 白娟 李文良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3445-3454,共10页

为确定华东地区发生腹泻的羊群中大肠杆菌感染、毒力基因携带及耐药性情况,本研究通过分离鉴定、进化分群、毒力基因检测、药敏试验等方法对发生腹泻的羊场病死羊肠道、粪便样品进行检测。结果显示,从187份样品中分离到163株大肠杆菌,其... 为确定华东地区发生腹泻的羊群中大肠杆菌感染、毒力基因携带及耐药性情况,本研究通过分离鉴定、进化分群、毒力基因检测、药敏试验等方法对发生腹泻的羊场病死羊肠道、粪便样品进行检测。结果显示,从187份样品中分离到163株大肠杆菌,其中B1群及A群的菌株占大多数,检出率分别为59.51%和28.83%;B2和D群的检出率分别为9.82%和1.84%。对分离菌株31个毒力基因进行检测,结果表明yijp、crlA、mat、ompA、fimC、ibeB 6种毒力基因的检出率均大于87%;所有菌株均未检出毒力基因afa/draB和LT。fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA在各进化群大肠杆菌均广泛存在。根据毒力基因检测结果,有72株菌为产志贺毒素大肠杆菌(STEC),主要携带毒力基因stx2。STEC另一标志性毒力基因eae检出率为61.11%。药敏试验检测的16种抗菌药中有4种的耐药率大于80%,有13种大于50%。属于多重耐药(MDR)的菌株有150株,占92.02%,且多为五重及以上耐药菌(84.05%)。华东地区临床流行的羊源大肠杆菌菌株毒力基因多样、耐药性普遍且耐药性强。该结果为本地区羊大肠杆菌病的防控提供了科学依据。 展开更多

关键词 大肠杆菌 羊 分离鉴定 进化群 毒力基因 多重耐药

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基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中SIgA

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作者 杨悦 王锐 +7 位作者 甘源 郝飞 谢星 张磊 邵国青 孟庆国 陈蓉 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3884-3894,共11页

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是黏膜免疫的主要效应分子,在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标,此外,基于SIgA的治疗性单抗和靶向SIgA产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的SIgA是产品研发的前提。为了提高猪初乳中S... 分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是黏膜免疫的主要效应分子,在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标,此外,基于SIgA的治疗性单抗和靶向SIgA产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的SIgA是产品研发的前提。为了提高猪初乳中SIgA的纯化效率,本研究采用串联亲和层析,强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化,从10 mL初乳中获得3 mg具有活性的SIgA。使用Western blot对纯化的SIgA进行鉴定,结果表明,纯化的SIgA与抗猪的重链蛋白单抗和抗SC单抗均具有良好的反应性。使用ELISA测试SIgA与抗猪的IgA重链单抗的反应性,结果发现使用本方法纯化的SIgA较原先方法(即硫酸铵沉淀,DEAE52弱阴离子层析,SephadexG-200凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。最后使用质谱鉴定纯化的蛋白,结果表明为猪的SIgA。本研究为从猪初乳中纯化SIgA建立了一种高效的纯化方法,也为其它来源的SIgA的纯化提供参考。 展开更多

关键词 猪初乳 SIGA 纯化 鉴定

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