人HPIP基因真核表达载体的构建及其对肺癌细胞的生物学影响 被引量：1

1

作者 葛祥伟 张德宇 +3 位作者 翟今朝 卢迪 叶棋浓 汪进良 《解放军医学院学报》 CAS 北大核心 2021年第12期1293-1297,1303,共6页

背景人造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(hematopoietic pre-B cell leukemia transcription factor interacting protein,HPIP)参与多种肿瘤的发生发展过程,其在肺癌中的机制仍有待研究。目的构建带有Flag标签的HPIP真核表达载体... 背景人造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(hematopoietic pre-B cell leukemia transcription factor interacting protein,HPIP)参与多种肿瘤的发生发展过程,其在肺癌中的机制仍有待研究。目的构建带有Flag标签的HPIP真核表达载体,表达pcDNA3.0-Flag-HPIP融合蛋白,检测其对肺癌细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。方法利用人乳腺文库作为模板,PCR技术扩增HPIP基因的编码序列,将其酶切产物连接到pcDNA3.0-Flag载体并测序。将重组质粒转染至A549肺癌细胞系中,Western blot验证转染后HPIP的蛋白表达情况。采用克隆形成实验、CCK-8法及细胞划痕实验等明确其对肺癌细胞增殖、迁移等功能的影响。结果PCR扩增得长度为2109 bp的HPIP基因编码序列,并成功插入至pcDNA3.0-Flag载体中。测序和Western blot验证融合蛋白构建成功。CCK-8法和克隆形成实验表明,与对照组相比,转染Flag-HPIP后肺癌A549细胞增殖能力显著增强。划痕实验证实转染Flag-HPIP后可明显提高肺癌A549细胞的迁移能力。结论本实验成功构建了带有Flag标签的HPIP基因真核表达载体,并证实其能够促进肺癌细胞的增殖和迁移,为后续HPIP在肺癌中的功能研究奠定了良好基础。 展开更多

关键词 人HPIP基因 真核表达 Flag标签 肺癌细胞 增殖

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NDR1对肝癌患者预后和肝癌细胞增殖、迁移的影响 被引量：2

2

作者 林燕妮 吴淑蒙 +3 位作者 任鑫鑫 谢天 李玲 叶棋浓 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第4期637-642,共6页

目的 分析核Dbf2相关激酶1(NDR1)在肝癌中的表达和临床预后的意义,探究NDR1在肝癌细胞中的生物学功能及其调控机制。方法 利用ENCORI数据库分析NDR1在肝癌组织及正常组织中的表达水平及其与肝癌患者生存率的关系。构建MYC-NDR1真核表达... 目的 分析核Dbf2相关激酶1(NDR1)在肝癌中的表达和临床预后的意义,探究NDR1在肝癌细胞中的生物学功能及其调控机制。方法 利用ENCORI数据库分析NDR1在肝癌组织及正常组织中的表达水平及其与肝癌患者生存率的关系。构建MYC-NDR1真核表达载体,转染肝癌HepG2细胞,通过蛋白质印迹法(Western blot)验证其表达;利用CCK-8法、细胞克隆形成实验和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。利用ENCORI数据库分析NDR1与c-Myc表达的相关性,并利用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)加药实验研究NDR1与c-Myc蛋白的关系。结果 ENCORI数据库分析显示,NDR1在肝癌组织中的表达高于正常组织且NDR1高表达患者总生存率低于低表达患者,差异有统计学意义(P<0.001);Western blot检测到MYC-NDR1蛋白条带;CCK-8法结果显示,MYC-NDR1组细胞生长速度快于空载体组(P<0.001);细胞克隆形成实验显示,MYC-NDR1组的克隆数高于空载体组(P<0.001);细胞划痕实验显示,MYC-NDR1组平均迁移距离大于空载体组(P<0.001);ENCORI数据库分析显示,NDR1与c-Myc表达有着相关性(R=0.184,P<0.001);CHX加药实验显示,在相同时间内,MYC-NDR1组中c-Myc蛋白的减少量低于空载体组。结论 NDR1在肝癌组织中高表达,与肝癌患者预后不良紧密相关,并与c-Myc基因的表达呈正相关;该研究成功构建了MYC-NDR1真核表达载体,表达产物MYC-NDR1能够增加c-Myc蛋白的稳定性,促进人肝癌细胞增殖和迁移。 展开更多

关键词 NDR1 真核表达载体 肝癌 C-MYC

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泛素特异性蛋白酶USP18在肺腺癌中的表达及其影响研究

3

作者 陈静漪 石烟祝 +4 位作者 蒋琦炜 葛祥伟 谢天 张德宇 叶棋浓 《军事医学》 CAS 2021年第7期505-509,共5页

目的拟探讨泛素特异性蛋白酶USP18在肺腺癌中的表达及其对人肺腺癌细胞A549增殖、迁移能力的影响。方法基于癌症数据库TCGA-LUAD中的转录组数据,分析USP18在肺腺癌中的表达量;通过基因富集分析,探索USP18在肺腺癌发生发展中的功能。利... 目的拟探讨泛素特异性蛋白酶USP18在肺腺癌中的表达及其对人肺腺癌细胞A549增殖、迁移能力的影响。方法基于癌症数据库TCGA-LUAD中的转录组数据,分析USP18在肺腺癌中的表达量;通过基因富集分析,探索USP18在肺腺癌发生发展中的功能。利用人肺腺癌A549细胞过表达USP18蛋白,生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究USP18对A549细胞增殖、迁移能力的影响。结果在TCGA-LUAD数据库中,相比于癌旁组织,肺腺癌组织的USP18 mRNA水平明显升高;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染Flag-USP18的人肺腺癌A549细胞较转染空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染Flag-USP18的人肺腺癌A549细胞较转染空载体细胞迁移能力增强。结论肺腺癌细胞中USP18表达增强,且高表达的USP18可增强肺腺癌细胞增殖、迁移能力。 展开更多

关键词 泛素特异性蛋白酶类 USP18 TCGA 生物信息学 肺腺癌 A549细胞 细胞增殖 转染 干扰素类

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长链脂酰辅酶A合成酶家族与恶性肿瘤 被引量：3

4

作者 张秀娟 李玲 叶棋浓 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期875-884,共10页

脂肪酸代谢紊乱容易导致癌症的发生。长链脂酰辅酶A合成酶家族(long chain acyl-coenzyme A synthetase family,ACSLs)负责激活长链脂肪酸,在脂肪酸代谢中发挥重要作用。但在癌细胞中,其调控作用经常被解除,细胞内脂肪酸的分布、种类和... 脂肪酸代谢紊乱容易导致癌症的发生。长链脂酰辅酶A合成酶家族(long chain acyl-coenzyme A synthetase family,ACSLs)负责激活长链脂肪酸,在脂肪酸代谢中发挥重要作用。但在癌细胞中,其调控作用经常被解除,细胞内脂肪酸的分布、种类和数量发生改变,进而导致癌症和其他代谢性疾病的发生。ACSLs在哺乳动物中包括5种亚型,分别为ACSL1、3、4、5和6。ACSL1在甘油三脂的合成和分配中发挥重要作用;ACSL3有助于脂滴的形成,脂滴对维持脂质稳态具有重要作用;ACSL4的表达与类固醇激素相关,在铁死亡途径中发挥重要作用;ACSL5可以催化外源性脂肪酸的代谢,但不能催化从头合成脂肪酸的代谢;ACSL6在脑内的脂肪酸代谢及生殖器官中精子发生和卵巢功能维持等方面发挥重要作用。ACSLs的调控因子包括转录因子、共激活因子、激素受体、蛋白激酶和小的非编码RNA等。它们通过介导脂肪酸代谢,广泛参与线粒体介导的能量代谢,内质网应激和肿瘤炎性微环境等。此外,ACSLs还作为独立预后因素,成为各种癌症临床诊断和治疗的生物标志物和治疗靶点。近年来,越来越多的研究表明,ACSL家族在癌症的发生发展进程中发挥重要作用。本文从ACSL基因家族,ACSLs与恶性肿瘤及基于ACSLs脂代谢的肿瘤治疗方面进行阐述,为后续ACSL基因家族的研究及肿瘤的靶向治疗提供理论依据和候选分子靶标。 展开更多

关键词 长链脂酰辅酶A合成酶 脂代谢 恶性肿瘤 靶向治疗

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慢病毒介导shRNA沉默AP2β对肝癌细胞生物特性的影响

5

作者 马路园 霍楠 +6 位作者 朱祥 丛瑞 初众 唐枝 韩聚强 徐小洁 赵彩彦 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第9期669-673,共5页

目的通过构建慢病毒介导的靶向AP2β基因短发夹RNA(shRNA)重组质粒,观察AP2β低表达对肝细胞癌(HCC)细胞生物学功能的影响。方法构建人AP2β慢病毒shRNA质粒,将重组质粒转染至人胚肾293T细胞。AP2βshRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞... 目的通过构建慢病毒介导的靶向AP2β基因短发夹RNA(shRNA)重组质粒,观察AP2β低表达对肝细胞癌(HCC)细胞生物学功能的影响。方法构建人AP2β慢病毒shRNA质粒,将重组质粒转染至人胚肾293T细胞。AP2βshRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞包装成慢病毒后感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞,通过实时定量PCR(qRT-PCR)及Western印迹检测AP2βshRNA干扰效果;利用CCK-8法和细胞划痕实验检测沉默AP2β对HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移的影响。结果AP2βshRNA能有效沉默AP2β基因;CCK-8法、细胞划痕实验提示,沉默AP2β可促进HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移。结论慢病毒介导的AP2β敲减重组质粒构建成功,且沉默AP2β可促进HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移,因此AP2β可能是HCC治疗的一个潜在新靶点。 展开更多

关键词 癌 肝细胞 AP2β 短发夹RNA 慢病毒属 质粒 转染 HEK293细胞

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激活蛋白2家族基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

6

作者 米月 蒋琦炜 +2 位作者 沈雁婕 张德宇 叶棋浓 《基础医学与临床》 2022年第12期1829-1834,共6页

目的构建激活蛋白2(AP-2)家族真核表达载体,探究AP-2α、AP-2β、AP-2γ对人肝癌细胞系HepG2增殖及迁移的影响。方法模板为人卵巢文库,通过PCR扩增AP-2α、AP-2β以及AP-2γ,并与载体pCDNA3.0-FLAG连接得到真核表达载体pCDNA3.0-FLAG-A... 目的构建激活蛋白2(AP-2)家族真核表达载体,探究AP-2α、AP-2β、AP-2γ对人肝癌细胞系HepG2增殖及迁移的影响。方法模板为人卵巢文库,通过PCR扩增AP-2α、AP-2β以及AP-2γ,并与载体pCDNA3.0-FLAG连接得到真核表达载体pCDNA3.0-FLAG-AP-2α/β/γ;通过CCK8法、克隆形成实验和划痕实验分别验证AP-2α、AP-2β以及AP-2γ对肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响。结果成功构建了AP-2基因家族主要成员AP-2α、AP-2β、AP-2γ的真核表达载体,经酶切及基因测序鉴定重组质粒AP-2家族转录因子构建成功,并且能够成功表达;同时经过功能鉴定,显示AP-2家族蛋白可以显著抑制HepG2细胞的增殖以及迁移(P<0.05)。结论构建的AP-2家族基因真核表达载体转染至HepG2细胞后,明显抑制HepG2细胞增殖和迁移。 展开更多

关键词 人AP-2基因家族 肝癌 真核表达 HEPG2细胞系

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细胞自噬与肿瘤发生发展 被引量：9

7

作者 蒋琦炜 张德宇 +3 位作者 石烟祝 葛祥伟 谢天 叶棋浓 《军事医学》 CAS 2021年第3期234-240,F0003,共8页

自噬是真核生物中一种高度保守的胞内降解途径。其主要通过溶酶体或液泡进行饥饿状态下的营养动员,清除受损蛋白质、细胞器和胞内病原体。自噬主要包括巨自噬、分子伴侣介导自噬(CMA)和微自噬。自噬已被证实与多种人类疾病相关,其在肿... 自噬是真核生物中一种高度保守的胞内降解途径。其主要通过溶酶体或液泡进行饥饿状态下的营养动员,清除受损蛋白质、细胞器和胞内病原体。自噬主要包括巨自噬、分子伴侣介导自噬(CMA)和微自噬。自噬已被证实与多种人类疾病相关,其在肿瘤发生发展中具有重要意义。近年研究中,对于自噬和肿瘤关系有了进一步的认识,该文就自噬分子机制、调控通路以及与肿瘤发生发展关系的研究进展作一综述。 展开更多

关键词 自噬 肿瘤 巨自噬 分子伴侣介导自噬 微自噬

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人Tinagl1基因抑制宫颈癌细胞生长与迁移

8

作者 唐枝 高晓超 +6 位作者 马路园 朱祥 初众 张德宇 徐小洁 闫志风 阳志军 《军事医学》 CAS 北大核心 2020年第7期506-509,514,共5页

目的构建带pXJ-40-Myc标签的人肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1(Tinagl1)真核表达载体,表达pXJ-40-Myc-Tinagl1融合蛋白,检测其对人宫颈癌细胞生长的影响。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增Tinagl1编码区序列,双酶切后将其插入pXJ-4... 目的构建带pXJ-40-Myc标签的人肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1(Tinagl1)真核表达载体,表达pXJ-40-Myc-Tinagl1融合蛋白,检测其对人宫颈癌细胞生长的影响。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增Tinagl1编码区序列,双酶切后将其插入pXJ-40-Myc载体中,构建pXJ-40-Myc重组质粒;将重组质粒与空载体分别转染人宫颈癌HeLa细胞,Western印迹鉴定目的基因表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对宫颈癌HeLa细胞生长的影响,划痕实验检测Tinagl1对HeLa细胞运动迁移能力的影响。结果双酶切鉴定表明,pXJ-40-Myc-Tinagl1真核表达质粒构建成功;转染HeLa细胞后融合蛋白表达,生长曲线、克隆形成及划痕实验结果表明,Tinagl1可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。结论携带pXJ-40-Myc标签的人Tinagl1基因真核表达载体能在人宫颈癌HeLa细胞中表达,且能抑制该细胞的生长。该实验为进一步研究Tinagl1在肿瘤,尤其是妇科恶性肿瘤中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 Tinagl1 宫颈肿瘤 HELA细胞 克隆形成 细胞增殖

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C-myc对Erastin诱导肝癌细胞铁死亡的影响 被引量：1

9

作者 陈静漪 张德宇 武建强 《军事医学》 CAS 2022年第7期524-529,共6页

目的通过生物信息学筛选肝癌细胞铁死亡潜在药物靶点,并实验验证和检测靶点抑制剂与铁死亡诱导剂Erastin联合用药的效果。方法利用高通量基因表达数据库(GEO)数据(GSE104462)进行基因富集分析,探索肝癌细胞中Erastin诱导的铁死亡相关通... 目的通过生物信息学筛选肝癌细胞铁死亡潜在药物靶点,并实验验证和检测靶点抑制剂与铁死亡诱导剂Erastin联合用药的效果。方法利用高通量基因表达数据库(GEO)数据(GSE104462)进行基因富集分析,探索肝癌细胞中Erastin诱导的铁死亡相关通路。在肝癌细胞系SK-Hep-1中利用验证性CCK-8、细胞凋亡以及划痕实验探究C-myc及其抑制剂10074-G5对肝癌SK-Hep-1细胞铁死亡的影响。结果基因富集分析发现,相比于对照组,Erastin诱导铁死亡时肝癌细胞中C-myc信号通路基因显著下调性富集;验证性CCK-8实验表明,C-myc过表达可减弱肝癌SK-Hep-1细胞对Erastin诱导铁死亡的敏感性,而10074-G5增强其敏感性;细胞凋亡、划痕实验表明,联用抑制剂10074-G5可增强Erastin对肝癌细胞的杀伤和迁移抑制作用;且C-myc过表达可部分消除Erastin诱导升高的二价铁离子,抑制剂10074-G5可增强Erastin诱导升高的二价铁离子。结论C-myc信号对肝癌细胞铁死亡起抑制性作用,联用C-myc抑制剂可显著增强诱导肝癌细胞铁死亡的敏感性。 展开更多

关键词 C-MYC 铁死亡 癌 肝细胞 SK-Hep-1细胞 细胞凋亡 生物信息学

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稳定低表达乳酸脱氢酶A对HepG2和ZR-75-1细胞糖代谢、增殖和迁移的影响 被引量：1

10

作者 蒋琦炜 石烟祝 +4 位作者 陈静漪 葛祥伟 谢天 张德宇 叶棋浓 《军事医学》 CAS 2021年第12期896-902,共7页

目的通过构建乳酸脱氢酶A(LDHA)稳定低表达的HepG2和ZR-75-1细胞系,观察LDHA表达降低对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞ZR-75-1糖代谢、增殖、迁移的影响。方法采用慢病毒介导的LDHA-shRNA载体,将新构建质粒转染至HEK293T细胞中检测抑制效果... 目的通过构建乳酸脱氢酶A(LDHA)稳定低表达的HepG2和ZR-75-1细胞系,观察LDHA表达降低对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞ZR-75-1糖代谢、增殖、迁移的影响。方法采用慢病毒介导的LDHA-shRNA载体,将新构建质粒转染至HEK293T细胞中检测抑制效果,实时定量PCR检测LDHA mRNA水平,Western印迹检测蛋白水平。对经嘌呤霉素筛选后感染慢病毒的稳定低表达LDHA的HepG2和ZR-75-1细胞进行功能测定,利用糖代谢相关试剂盒检测敲低后肿瘤细胞中糖摄取、三磷酸腺苷(ATP)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸水平;利用生长曲线实验和克隆形成实验检测LDHA基因表达降低对细胞增殖的影响;利用划痕实验检测LDHA表达降低对细胞迁移能力的影响。结果实时定量PCR及Western印迹结果显示,LDHA表达在mRNA水平及蛋白水平上均受到了抑制;糖代谢相关试剂盒检测结果表明稳定低表达LDHA的肿瘤细胞中糖摄取、ATP水平、LDH和乳酸水平均明显下降;生长曲线实验(CCK-8法)和克隆形成实验显示,慢病毒介导的LDHA shRNA能明显抑制肿瘤细胞的增殖;划痕实验显示,敲低LDHA后HepG2和ZR-75-1细胞迁移能力受到了明显抑制。结论 LDHA表达降低可明显抑制肿瘤细胞中糖摄取、ATP、LDH和乳酸水平并且抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。 展开更多

关键词 乳酸脱氢酶A SHRNA HEPG2 ZR-75-1 糖代谢 细胞增殖和迁移

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人LDHA基因真核表达载体的构建及其功能鉴定 被引量：1

11

作者 张德宇 马路园 +5 位作者 朱祥 刘娟 杨旭辉 陈玉 徐小洁 叶棋浓 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第6期406-410,共5页

目的构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体上,经双酶切和测序鉴定成功后转染到肝癌HepG2细胞中... 目的构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体上,经双酶切和测序鉴定成功后转染到肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,免疫荧光检测其亚细胞定位,并利用生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究LDHA对肝癌HepG2细胞增殖、迁移能力的影响。结果从人乳腺文库中扩增获得大小约为1000 bp的DNA片段,并成功克隆至pEGFP-C1载体上,经测序与目的序列完全一致;转染肝癌HepG2细胞后目的基因成功表达;荧光显微镜观察发现,GFP-LDHA融合蛋白主要聚集于细胞质中;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞迁移性增强。结论成功构建了带GFP标签的人LDHA真核表达载体,为进一步研究LDHA在肝癌细胞中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 人LDHA基因 克隆 真核表达 HepG2肝癌细胞株 聚合酶链反应 绿色荧光蛋白质类

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带GFP标签的SQSTM1真核表达载体的构建及功能验证

12

作者 朱祥 陈玉 +5 位作者 马路园 张德宇 刘娟 于世炎 聂秀红 徐小洁 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第6期411-414,共4页

目的构建带绿色荧光蛋白报告载体(pEGFP-C1)的死骨片1(SQSTM1/P62)真核表达载体,在获得pEGFPSQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增人SQSTM1基因编码序列,插入到pEGFP-C1载体中,把... 目的构建带绿色荧光蛋白报告载体(pEGFP-C1)的死骨片1(SQSTM1/P62)真核表达载体,在获得pEGFPSQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增人SQSTM1基因编码序列,插入到pEGFP-C1载体中,把测序正确的重组质粒转染人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法(Western blotting)检测该融合蛋白表达情况;分别转染pEGFP-C1空载体、pEGFP-SQSTM1至乳腺癌细胞ZR75-1,荧光显微镜观察SQSTM1蛋白在细胞中的定位情况;荧光漂白后恢复实验(FRAP)验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体荧光漂白后恢复情况。结果重组质粒pEGFP-SQSTM1的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜观察SQSTM1的表达,结果显示,表达产物主要以点状小体形式定位于乳腺癌ZR75-1细胞的胞质中;FRAP实验验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体激光漂白后绿色荧光可恢复。结论成功构建pEGFPSQSTM1真核表达载体,证实了SQSTM1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1中表达,表达蛋白以点状小体形式定位于细胞质中,为进一步研究SQSTM1小体的功能提供基础。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 ZR75-1 pEGFP-SQSTM1 SQSTM1 SQSTM1小体 绿色荧光蛋白质类 聚合酶链反应

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带Flag标签的Sirt4真核表达载体的构建及功能验证

13

作者 朱祥 马晓燕 +5 位作者 马路园 张德宇 刘娟 杨旭辉 赵彩彦 徐小洁 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第1期37-41,共5页

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的Sirt4真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞HepG2生长之间的关系。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增出Sirt4的CDS区编码序列,将PCR产物插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α... 目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的Sirt4真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞HepG2生长之间的关系。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增出Sirt4的CDS区编码序列,将PCR产物插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞提取质粒,测序正确后将pcDNA3.0-Flag和pcDNA3.0-Flag-Sirt4分别转染肝癌细胞HepG2,Western印迹实验鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对肝癌细胞HepG2生长的影响,Transwell证明Sirt4对肝癌细胞HepG2体外侵袭能力的影响。结果双酶切结果显示,pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功;Western印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明过表达Sirt4基因抑制HepG2细胞增殖,Transwell证明过表达Sirt4明显抑制HepG2细胞体外侵袭能力。结论pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功,过表达Sirt4基因可抑制肝癌细胞增殖及体外侵袭能力,为进一步研究Sirt4在肝癌中的发生与发展奠定了基础。 展开更多

关键词 肝肿瘤 HEPG2 pcDNA3.0-Flag-Sirt4 细胞增殖 质粒 转染

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带Flag标签的Sirt2真核表达载体的构建及其与PKM2的相互作用

14

作者 朱祥 李齐宏 +7 位作者 霍楠 丛瑞 马路园 初众 唐枝 李春雨 徐小洁 闫志风 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第7期510-513,共4页

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2(Sirt2)真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相互结合。方法利用聚合酶链反应(PCR)从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切... 目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2(Sirt2)真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相互结合。方法利用聚合酶链反应(PCR)从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切后pcDNA3.0-Flag载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,验证表达,测序正确后,分别转染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共转染至人胚肾细胞(293T),通过免疫共沉淀实验证明Sirt2蛋白表与PKM2蛋白有相互结合。结果重组质粒Flag-Sirt2的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;免疫共沉淀实验证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合。结论成功构建了Flag-Sirt2真核表达载体,证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合,为进一步研究Sirt2在糖酵解中发挥的功能提供了基础。 展开更多

关键词 人胚肾细胞 沉默信息调节因子2 丙酮酸激酶 免疫共沉淀 转染

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透明质酸介导运动受体真核表达载体的构建及其对乳腺癌增殖和迁移的影响 被引量：2

15

作者 石烟祝 陈静漪 +5 位作者 蒋琦炜 葛祥伟 谢天 杨子荣 张德宇 叶棋浓 《军事医学》 CAS 2021年第3期161-165,共5页

目的构建透明质酸介导运动受体(HMMR)真核表达重组质粒并在乳腺癌ZR75-1细胞中转染和鉴定,探究HMMR对乳腺癌细胞生长、增殖和迁移的影响。方法采用PCR技术以人乳腺文库为模板扩增HMMR基因并与pcDNA3.0-FLAG载体在EcoRⅤ和XhoⅠ酶切位点... 目的构建透明质酸介导运动受体(HMMR)真核表达重组质粒并在乳腺癌ZR75-1细胞中转染和鉴定,探究HMMR对乳腺癌细胞生长、增殖和迁移的影响。方法采用PCR技术以人乳腺文库为模板扩增HMMR基因并与pcDNA3.0-FLAG载体在EcoRⅤ和XhoⅠ酶切位点进行连接,构建真核表达载体(pcDNA3.0-FLAG-HMMR),并转染乳腺癌ZR75-1细胞;通过Western印迹法、CCK8实验和克隆形成检测HMMR基因表达对ZR75-1生长的影响,划痕实验验证真核表达载体对ZR75-1细胞迁移的影响。结果经酶切鉴定及序列测序验证真核重组表达载体构建成功,并在ZR75-1细胞中表达;并且发现HMMR对ZR75-1细胞的增殖和迁移具有显著的促进作用。结论构建的真核表达载体转染至ZR75-1细胞后,明显促进ZR75-1增殖和迁移,这为研究HMMR基因在乳腺癌发生发展机制奠定了基础。 展开更多

关键词 透明质酸介导运动受体 真核表达载体 聚合酶链反应 乳腺肿瘤 ZR75-1

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SLC25A5基因真核表达载体的构建及其功能验证

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作者 亢小峰 霍楠 +8 位作者 丛瑞 马路园 初众 唐枝 孙志佳 贾松浩 刘含笑 徐小洁 张萍 《军事医学》 CAS 北大核心 2020年第12期926-929,946,共5页

目的构建SLC25A5基因的真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞生长之间的关系。方法以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出SLC25A5的CDS区编码序列,应用双酶切将PCR产物插入到带Flag标签的pCMV-Tag2B载体上,酶切和测序验证后转染到人肝... 目的构建SLC25A5基因的真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞生长之间的关系。方法以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出SLC25A5的CDS区编码序列,应用双酶切将PCR产物插入到带Flag标签的pCMV-Tag2B载体上,酶切和测序验证后转染到人肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,CCK-8法、克隆形成实验测定其对肝癌HepG2细胞生长的影响。结果双酶切结果显示,pCMV-Tag2B-Flag-SLC25A5真核表达载体构建成功;提取质粒转染人肝癌HepG2细胞;Western印迹技术验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明过表达pCMV-Tag2B-Flag-SLC25A5促进肝癌HepG2细胞增殖。结论pCMV-Tag2B-Flag-SLC25A5真核表达载体构建成功,并证明其可促进肝癌细胞增殖,为进一步研究SLC25A5在肝癌中的发生发展作用奠定了基础。 展开更多

关键词 SLC25A5基因 癌 肝细胞 HEPG2 真核表达 细胞增殖

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人乳酸脱氢酶A基因的原核表达及其蛋白的纯化

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作者 葛祥伟 陈静漪 +5 位作者 石烟祝 蒋琦炜 米月 谢天 叶棋浓 汪进良 《军事医学》 CAS 2021年第10期726-730,共5页

目的构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础。方法以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序。LDHA在大肠杆菌中进行诱... 目的构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础。方法以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序。LDHA在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE及Western印迹检测蛋白纯化效果。采用His pull-down技术检测纯化蛋白与沉默信息调节因子2(SIRT2)的相互作用。结果PCR扩增获得长度约1000 bp的LDHA编码序列,并插入到pET-28a(+)载体中,序列测定结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE及Western印迹结果显示获得带有His标签的LDHA蛋白。His pull-down实验证明His-LDHA能与SIRT2体外结合,证实其生物学活性良好。结论成功构建带His标签的LDHA基因原核表达载体,并得到纯化蛋白,为进一步研究LDHA蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 人乳酸脱氢酶A 原核表达 His标签 蛋白纯化

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