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副猪格拉瑟菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断和防治 被引量：1
1
作者 田梓翰 吴昊 +3 位作者 阮胜男 任文慧 吴昊蔚 何启盖 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第10期16-21,共6页
为了诊断某场育肥猪群突发呼吸系统疾病、高死亡率的病因,评估防治方案对该疫病的控制效果。本试验通过现场观察发病猪临床症状、濒死猪器官病变情况,结合实验室检测结果开展综合诊断;根据诊断结果制定了相应的防控方案并评价其效果。... 为了诊断某场育肥猪群突发呼吸系统疾病、高死亡率的病因,评估防治方案对该疫病的控制效果。本试验通过现场观察发病猪临床症状、濒死猪器官病变情况,结合实验室检测结果开展综合诊断;根据诊断结果制定了相应的防控方案并评价其效果。结果显示,该场发病猪为副猪格拉瑟菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的混合感染。制定的防控方案为:群体给药酒石酸泰万菌素和复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液控制住细菌感染后,迅速接种PRRSV弱毒苗,隔离发病猪,加强环境和流动人员消毒,记录不同栋舍猪群的存栏量和周死淘率直至猪群出栏。实施紧急防控方案后,暴发栋舍周死淘率显著低于采取措施之前(P<0.05),相连栋舍未暴发疾病。结果表明,群体给药酒石酸泰万菌素和复方磺胺间甲氧嘧啶钠,免疫PRRSV弱毒苗,配合控制人员和物资流动、加强猪舍环境管理等防治措施,能够有效的控制副猪格拉瑟菌和PRRSV混合感染。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 副猪格拉瑟菌 混合感染 弱毒疫苗 疾病诊断
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基于猪流行性腹泻病毒GⅡb亚型重组荧光病毒中和抗体检测方法的建立 被引量：1
2
作者 林莉莉 张梦迪 +5 位作者 朱琳琳 马海龙 孙琪 何启盖 张梦佳 李文涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1649-1660,共12页
2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CC... 2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CCL81上开展的PEDV经典中和试验中所添加的胰酶会导致试验结果不稳定等问题。本研究拟在构建稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒基础上,建立一种能准确评估样品中和抗体的检测方法。本研究在pUC57载体上克隆插入GⅡb亚型PEDV-GDU株部分ORF1a和ORF1b基因片段与其他结构基因片段,并通过无缝克隆技术将ORF3基因替换为EGFP基因,构建辅助质粒pUC57-PEDV-GDU-dORF3-EGFP,通过RNA定向重组技术拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP。进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)、Western blot和病毒生长曲线测定等方法,比较重组荧光病毒和亲本病毒生物学特性。最终利用重组荧光工具病毒筛选在不添加胰酶的条件下仍能支持PEDV有效增殖的细胞系,并建立中和试验方法。结果表明,成功拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP,且在Vero-CCL81细胞上,重组荧光病毒与亲本病毒呈现相似的生物学特性。利用该重组荧光病毒筛选到一株亚克隆Huh7.10细胞可支持PEDV在无外源胰酶添加条件下的有效感染与复制。并利用Huh7.10细胞和重组荧光病毒成功建立了PEDV中和试验方法,相关性试验分析表明,该方法测定结果与ELISA抗体检测结果相关性高于PEDV经典中和试验。以上试验结果表明,本研究成功建立了PEDV-GDU毒株的反向遗传操作平台,为PED新型疫苗候选毒株的快速制备提供了有力的工具。此外,基于重组荧光病毒在Huh7.10细胞上建立的中和试验方法能更准确地测定血清中和抗体水平,为疫苗免疫效果的评估提供了有效的技术支持手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 反向遗传学 胰蛋白酶 报告病毒 中和试验
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猪表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及其生物活性研究
3
作者 周鑫鑫 郭莹莹 +4 位作者 肖运才 王金硕 周祖涛 刘华珍 石德时 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2823-2836,共14页
【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转... 【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转至乳酸乳球菌NZ3900,以LacF为筛选标记获得重组菌pEGF-NZ。用nisin诱导重组菌pEGF-NZ表达重组蛋白pEGF,并通过Tricine-SDS-PAGE检测其表达情况。改良实验室及工业发酵条件以提高pEGF表达量。利用猪回肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖试验体外验证表达的pEGF生物活性。通过动物试验验证重组蛋白pEGF对小鼠及断奶仔猪腹泻的影响。【结果】试验成功构建重组菌pEGF-NZ,并分泌表达pEGF蛋白。体外试验结果显示,pEGF蛋白能促进细胞增殖。pEGF-NZ重组菌及其表达的pEGF蛋白能延缓小鼠腹泻发生时间,降低腹泻率,保护小鼠肠绒毛的完整性。与对照组相比,pEGF-NZ重组菌处理后,小鼠结肠中乳酸菌数显著增加(P<0.05),大肠杆菌数、肠球菌数显著降低(P<0.05),白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β含量显著降低(P<0.05),IL-13含量显著升高(P<0.05)。饲粮中添加pEGF-NZ重组菌后,断奶仔猪腹泻情况明显缓解,平均日增重有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。【结论】pEGF-NZ重组菌及其分泌表达的pEGF能够修复肠道屏障,抑制病原菌黏附,调控肠道菌群,其主要通过下调部分促炎因子、上调抑炎因子表达发挥抑炎效果,从而保护断奶仔猪肠道健康,有效缓解腹泻。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 pEGF-NZ重组菌 猪表皮生长因子(pEGF)
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牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立 被引量：6
4
作者 徐恩红 祁明普 +5 位作者 项志杰 胡长敏 陈颖钰 陈建国 陈曦 郭爱珍 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期38-47,共10页
为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病... 为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)以及牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus type,BPIV) 3型a和c基因型(BPIV-3a,-3c)的N基因等为检测靶标,分别设计特异性引物和Taqman探针,通过优化反应条件,采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应,与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%,组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测,P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%;其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式,主要由M.b与其他病原体的混合感染,占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高,占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三,其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30);其次为IBRV,占26.7%(8/30);BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明,该方法具有较高的分析敏感性和特异性,可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。 展开更多
关键词 多联实时荧光定量PCR方法 牛呼吸疾病综合征 混合感染 牛支原体 多杀性巴氏杆菌 牛溶血性曼氏杆菌 多病原联合检测
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应用基于重组慢病毒的CRISPR/Cas9技术构建基因突变的鸡DF1细胞 被引量：3
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作者 靳泽华 谢梦利 +4 位作者 易辰阳 黄英 付磊 王晓萍 张安定 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期83-88,共6页
为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否... 为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1 220 bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300 bp和900 bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 慢病毒 鸡DF1细胞 基因编辑
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鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的可溶性表达
6
作者 黄英 付磊 +3 位作者 靳泽华 易辰阳 王晓萍 张安定 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第8期16-19,24,共5页
为了获得具有活性的鸡传染性贫血病毒(CIAV)的衣壳蛋白,给疫苗的研制和诊断试剂的开发提供新的思路。根据已发表的CIAV VP 1编码基因的序列并结合大肠杆菌偏爱密码子分析,合成了VP 1(去掉N′端80个氨基酸)的编码序列,并利用大肠杆菌进... 为了获得具有活性的鸡传染性贫血病毒(CIAV)的衣壳蛋白,给疫苗的研制和诊断试剂的开发提供新的思路。根据已发表的CIAV VP 1编码基因的序列并结合大肠杆菌偏爱密码子分析,合成了VP 1(去掉N′端80个氨基酸)的编码序列,并利用大肠杆菌进行表达,SDS-PAGE结果表明,表达产物主要为不可溶的包涵体蛋白。进一步利用伴侣蛋白使VP1蛋白的可溶性表达产量得到提高,并确定了诱导重组表达VP1蛋白的最佳条件:16℃、0.08 mmol/L IPTG诱导。利用Ni 2+树脂对重组VP1蛋白进行纯化,然后利用间接ELISA方法进行检测,发现该重组蛋白可与CIAV阳性血清发生反应。本研究成功利用伴侣蛋白促进VP1蛋白的可溶性表达,而且表达的VP1蛋白有良好的免疫反应,具有开发为新型亚单位疫苗和诊断抗原的潜力。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 衣壳蛋白 大肠杆菌 伴侣蛋白 可溶性表达
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生物素连接酶BirA及其突变体在病原与宿主互作研究中的应用进展
7
作者 张含煜 李鹏飞 +5 位作者 廖浙屿 张梦佳 孙玉梅 张敏 何启盖 李文涛 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1981-1996,共16页
蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋... 蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法,邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势,被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述,阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理,以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。 展开更多
关键词 蛋白质 相互作用 邻近标记 BirA 生物素
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环状RNA及其研究进展 被引量：2
8
作者 孔德来 朱一帆 +2 位作者 翟文俊 郭爱珍 陈颖钰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期349-355,共7页
环状RNA是非编码RNA家族的重要成员之一,广泛存在于真核生物内,并参与多种疾病的发生发展。本文就环状RNA的生物学特征、功能及其在畜牧兽医和人类疾病如结核病领域的研究进展进行综述,并分析了环状RNA的未来研究方向和亟待解决的一些问... 环状RNA是非编码RNA家族的重要成员之一,广泛存在于真核生物内,并参与多种疾病的发生发展。本文就环状RNA的生物学特征、功能及其在畜牧兽医和人类疾病如结核病领域的研究进展进行综述,并分析了环状RNA的未来研究方向和亟待解决的一些问题,期望能为相关研究提供有价值的参考。 展开更多
关键词 环状RNA 非编码RNA 调节 疾病 转录 结核病
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