猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立 被引量：1

1

作者 张宝戈 黄雅琴 +2 位作者 蔡金双 朱晨光 李玉峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1170-1178,共9页

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

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伪狂犬病病毒VP22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

2

作者 潘梦娇 刘德鹏 +4 位作者 郭磊 赵桐 白娟 姜平 刘星 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第5期82-89,共8页

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接EL... 为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接ELISA方法筛选,经3次亚克隆后获得4株PRV VP22蛋白的单克隆抗体1D6、1D9、1B12和2C10。间接ELISA检测4株杂交瘤细胞传至15代均能稳定分泌抗体,且细胞上清液抗体效价均为1∶6400。经亚型鉴定,4株单克隆抗体的重链均是IgG1亚类,轻链皆属于κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体均可与PRV发生特异性反应,并鉴定出2个抗原表位;Western blot和共聚焦试验结果表明,VP22蛋白是病毒早期蛋白,且早期存在于细胞质,晚期移位至细胞核并在核中积累。本研究制备的单克隆抗体将为后续探索PRV VP22蛋白的功能提供材料支撑。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 VP22蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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2021—2022年南京市野猪中8种病毒感染情况及PCV2全基因组遗传进化分析

3

作者 王怡 李梅荣 +6 位作者 李树博 冯春燕 杜季梅 邓长林 程王琨 姜平 杨振 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第1期107-114,共8页

野猪是多种重要动物疫病的天然宿主,为了解2021—2022年期间南京市野猪疫病感染情况、基因型及遗传变异特征,为野猪疫病的防控提供科学依据,在江苏省南京市共采集30头野猪的76份样品,其中30份全血样品、30份血清样品、6份粪便样品和10... 野猪是多种重要动物疫病的天然宿主,为了解2021—2022年期间南京市野猪疫病感染情况、基因型及遗传变异特征,为野猪疫病的防控提供科学依据,在江苏省南京市共采集30头野猪的76份样品,其中30份全血样品、30份血清样品、6份粪便样品和10份组织样品(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织的混合样品)用于开展猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的病毒核酸及抗体检测。不同样品PCR检测结果显示,30头野猪中有12头PCV3阳性,阳性率为40%;PCV2阳性率为6.7%;其余病原核酸检测均为阴性。在PCV2检测阳性的野猪样品中成功获得2条PCV2全基因组序列,且均属于PCV2d基因亚型。血清抗体检测结果显示,野猪PCV3、PCV2、PRV gB、PRRSV、PEDV和FMDV A型抗体阳性率分别为53%、30%、30%、3.3%、3.3%和6.7%;所有野猪CSFV、ASFV、PRV gE抗体和FMDV O型抗体检测均为阴性。本研究揭示了南京市野猪携带或感染过多种重要病毒,需持续对野猪进行疫病监测,并研究野猪与家猪间的疾病传播规律。 展开更多

关键词 野猪 病毒 监测 抗体 南京

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纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响

4

作者 李鑫椿 王硕玥 吴宗福 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期923-931,共9页

[目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株... [目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株构建、不同条件下的生长曲线测定、小鼠毒力试验等评价其对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[结果]巴氏链球菌WUSP067基因组中存在2个潜在的纤维二糖利用相关基因簇(cellobiose locus, CL),将其分别命名为CL1和CL2,它们均包括编码磷酸转移酶系统和β-葡萄糖苷酶的基因。RT-qPCR结果显示,与添加10 g·L^(-1)葡萄糖的DMEM培养基相比,在添加10 g·L^(-1)纤维二糖的DMEM培养基中,CL1中的BglP1_(wp)和BglA_(wp)基因表达量无显著差异,而CL2中celA_(wp)和celB_(wp)基因表达极显著上调(P<0.000 1),分别上调49倍和33倍,提示其参与利用纤维二糖。选择CL2深入研究,RT-PCR结果显示,该基因簇由2个操纵子组成。构建编码β-葡萄糖苷酶的celA_(wp)基因缺失株,生长曲线分析表明,野生株和celA_(wp)基因缺失(ΔcelA_(wp))株在THB、DMEM+10 g·L^(-1)葡萄糖条件下生长情况无明显差异,但在DMEM+10 g·L^(-1)纤维二糖条件下,野生株能以纤维二糖为唯一碳源生长,而ΔcelA_(wp)表现出明显的生长缺陷,生长12 h时D_(600)仍低于0.5。以断奶仔鼠为感染模型,比较野生株和ΔcelA_(wp)株的毒力,每鼠攻毒剂量为3×10^(8) CFU,野生株攻毒组小鼠3日内全部死亡,而ΔcelA株攻毒组的小鼠死亡趋势较缓,14 d后存活率为20%(P<0.05)。[结论]猪源巴氏链球菌WUSP067能以纤维二糖为唯一碳源生长,CL2是纤维二糖利用相关基因簇,其中celA_(wp)基因不仅促进该菌利用纤维二糖,而且还影响该菌的毒力,在巴氏链球菌致病过程中发挥作用。 展开更多

关键词 巴氏链球菌 纤维二糖 生长 毒力

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副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

5

作者 陈敏 刘明星 +2 位作者 张鹏云 蔺辉星 范红结 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期304-316,共13页

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,... 旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。 展开更多

关键词 副猪格拉瑟菌 外膜囊泡 细胞致死性膨胀毒素CdtB 猪呼吸道上皮细胞

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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：2

6

作者 胡晓静 张路捷 +3 位作者 张杰 孙海凤 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第5期103-109,共7页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800~1∶25600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47~57 aa、57~67 aa及67~77 aa区域,其中57~67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒 被引量：1

7

作者 马梓承 刘星 +2 位作者 白娟 高雁怩 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第6期101-107,共7页

旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)UL21基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(sgRNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19 UL21-Left-Right-GFP),将其与PR... 旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)UL21基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(sgRNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19 UL21-Left-Right-GFP),将其与PRV基因组共转染HEK-293T细胞,通过蚀斑纯化获得PRV-ΔUL21病毒,并通过PCR和Western blot检测方法鉴定该毒株成功缺失了UL21基因。结果表明,CRISPR/Cas9技术可用于构建PRV基因缺失重组病毒,为PRV致病机制研究提供重要依据。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 UL21 CRISPR/Cas9 基因缺失

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猪流行性腹泻病毒结构与非结构蛋白诱导细胞凋亡的研究 被引量：1

8

作者 欧芳玲 朱慧欣 +2 位作者 李紫彤 刘星 王先炜 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第1期60-68,共9页

为了弄清猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后诱导细胞凋亡的关键蛋白,采用基因克隆技术构建PEDV相关病毒蛋白的真核表达质粒,转染至HEK-293T细胞,通过流式细胞术检测其细胞凋亡率。结果显示:PEDV非结构蛋白Nsp3和Nsp5以及结构蛋白M的重组质... 为了弄清猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后诱导细胞凋亡的关键蛋白,采用基因克隆技术构建PEDV相关病毒蛋白的真核表达质粒,转染至HEK-293T细胞,通过流式细胞术检测其细胞凋亡率。结果显示:PEDV非结构蛋白Nsp3和Nsp5以及结构蛋白M的重组质粒转染细胞后显著诱导细胞凋亡,且诱导的细胞凋亡呈现时间和剂量依赖性,提示Nsp3、Nsp5和M蛋白可能是PEDV的关键促凋亡因子。该结果为进一步研究PEDV诱导细胞凋亡的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 细胞凋亡 Nsp3 Nsp5 M蛋白

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2021—2022年山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查 被引量：4

9

作者 姜丹丹 王凯月 +1 位作者 杜以军 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第6期87-92,共6页

为研究2021—2022年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在山东地区的流行情况,从疑似发病的猪场采集了103份临床样本,采用RT-PCR方法对样品进行检测,并对阳性样品进行GP5和NSP2基因的序列测定、遗传进化分析以及同源性分析。结果显示:103份... 为研究2021—2022年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在山东地区的流行情况,从疑似发病的猪场采集了103份临床样本,采用RT-PCR方法对样品进行检测,并对阳性样品进行GP5和NSP2基因的序列测定、遗传进化分析以及同源性分析。结果显示:103份样品中检测到21份阳性样品,阳性率为20.38%。最终有5个样品能够同时扩增出GP5和NSP2基因序列,遗传进化分析显示,这5个样品中有2个属于谱系(lineage)1;2个属于lineage 5;1个属于lineage 8。各样品之间GP5基因的核苷酸同源性为81.5%~99.3%,NSP2基因的核苷酸同源性为56.9%~99.4%。本研究表明2021—2022年山东地区的PRRSV传播呈现多样性,为PRRSV毒株的遗传变异、演化分析和防控提供了理论基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 同源性 流行病学 遗传变异 进化分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

10

作者 袁丽 孙杨杨 +4 位作者 张路捷 张杰 孙海凤 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3424-3434,共11页

旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接... 旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接免疫荧光试验和蛋白印迹鉴定单克隆抗体特异性。通过构建GP3蛋白基因截短体和合成多肽ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。结果显示,成功筛选了7株稳定分泌GP3蛋白抗体的杂交瘤细胞株,7株单克隆抗体均可与PRRSV FJ1402产生特异性反应。鉴定出GP3蛋白4个抗原表位,分别为^(55)PLCPTRQAAAEILE^(68)、^(69)PGKSFWCRI^(77)、^(78)GHDRCSESDH^(87)和^(88)DELGFMVPPGLSS^(100)。2E12单抗与FJ1402、BB0907和S1三个谱系毒株均可发生IFA和Western blot特异反应,4H9、9F3和6B3单抗只与FJ1402毒株反应,而不与BB0907和S1毒株反应。本研究研制成功7株GP3蛋白单克隆抗体,并鉴定出4个GP3蛋白抗原表位,为PRRSV检测和GP3蛋白功能研究提供了重要工具。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP3蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

11

作者 王冠萱 陈萌萌 +8 位作者 仇汝龙 范志宇 胡波 宋艳华 魏后军 葛雷 徐为中 王芳 钱莺娟 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第18期40-44,共5页

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血... 兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。 展开更多

关键词 兔出血症病毒1型 兔出血症病毒2型 双重TaqMan qPCR

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伪狂犬病病毒TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪毒力稳定性检测

12

作者 姜辰龙 马梓承 +4 位作者 吕林 刘星 白娟 孙杨杨 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第8期51-56,共6页

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临... 旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临床症状,鼻腔排毒3~6 d,免疫后7、14、21 d,猪脑组织检测到PRV,其他组织均无病毒。仔猪滴鼻和肌肉注射F5、F30和F35代次ZJ01R病毒液,体温正常,无明显临床症状和病理变化,无病毒血症,鼻腔排毒时间仅为6 d;仔猪接种后7和14 d,肝脏和肺脏组织病毒检测均阴性,脑组织病毒核酸阳性;感染仔猪血清PRV gB ELISA抗体阳性,gE ELISA抗体阴性,表明ZJ01R毒株35代内对仔猪无临床致病作用,病毒毒力稳定性较好。 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 TK/gE/gI基因缺失 毒力稳定性

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Dermcidin促进猪流行性腹泻病毒复制的研究

13

作者 王远 王先炜 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期110-118,共9页

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病,可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻,造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响,本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR... 猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病,可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻,造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响,本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID_(50)等方法,通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平,并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平,探究其作用的分子机制。研究表明,DCD能够参与PEDV感染;DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制,而敲低DCD抑制了PEDV复制;DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化,从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制,对今后PEDV防治工作有重要参考意义。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 Dermcidin(DCD) 病毒复制 自噬

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一例PEDV S-INDEL重组毒案例的复盘分析

14

作者 张欣 崔敏 +3 位作者 杨雷 王云龙 刘海成 姜平 《今日养猪业》 2023年第1期77-80,共4页

山东省烟台市某规模化猪场哺乳仔猪发生以水样腹泻为主要症状的临床案例,采集腹泻病料,荧光定量PCR检测流行性腹泻抗原阳性,阳性样品进行测序分析,遗传进化分析位于新型PEDV毒株中的G1b亚型,首次发现PEDV S-INDEL重组毒。通过紧急防控措... 山东省烟台市某规模化猪场哺乳仔猪发生以水样腹泻为主要症状的临床案例,采集腹泻病料,荧光定量PCR检测流行性腹泻抗原阳性,阳性样品进行测序分析,遗传进化分析位于新型PEDV毒株中的G1b亚型,首次发现PEDV S-INDEL重组毒。通过紧急防控措施,疫情未发生扩散,通过复盘分析,确定此次疫情来源于引种所致。 展开更多

关键词 流行性腹泻 水样腹泻 PEDV 腹泻病 测序分析 哺乳仔猪 规模化猪场 荧光定量PCR检测

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山东省某规模猪场猪伪狂犬病毒变异毒株的分离与鉴定 被引量：2

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作者 张欣 崔敏 +4 位作者 姜辰龙 孙涛 白娟 刘星 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第3期73-78,共6页

2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201... 2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201和ZJ01株序列同源性为99.4%~99.8%,且位于同一遗传进化分支。选择70日龄PRV阴性健康猪接种PRV-YT株,发病率和死亡率均达100%(5/5),均表现严重脑组织、肝脏与肺脏损伤,表明PRV-YT株为猪伪狂犬病病毒变异强毒株。本研究为制定猪伪狂犬病防控方案提供了重要基础。 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 分离鉴定 PRV-YT株

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扬子鳄源普通变形杆菌FliL基因缺失株的构建及其特性分析 被引量：1

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作者 李林俐 朱来旭 +1 位作者 张雪 费荣梅 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期729-735,共7页

[目的]本文旨在研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌(Proteus vulgaris from Alligator sinensis)生物学特性的影响。[方法]在扬子鳄源普通变形杆菌野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基... [目的]本文旨在研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌(Proteus vulgaris from Alligator sinensis)生物学特性的影响。[方法]在扬子鳄源普通变形杆菌野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基因缺失株和互补株的生长曲线分析,探究FliL基因缺失对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的影响;利用细菌具有周期性群集运动特性,通过分析FliL基因缺失株与野生株在固体LB培养基和Mot半固体培养基上的迁移运动,探究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌运动的影响;通过小鼠致病性试验,探究FliL基因对细菌毒力的影响。[结果]细菌接种后5 h内FliL基因缺失株与野生株生长速度基本无差别,5 h后其生长速度慢于野生株;细菌群集运动和细菌动力试验显示,FliL基因缺失株群集运动明显减弱,但仍可在Mot半固体琼脂培养基上正常进行迁移运动;小鼠致病性试验显示,野生株XX2的LD_(50)为2.3×10^(6) CFU·mL^(-1),FliL基因缺失株XX2ΔFliL的LD_(50)为4.9×10^(8) CFU·mL^(-1),FliL基因缺失株LD_(50)升高了约100倍。[结论]FliL基因缺失可显著降低扬子鳄源普通变形杆菌的群集运动和细菌毒力,将为进一步研究扬子鳄源普通变形杆菌介导的扬子鳄痛风等疾病奠定基础。 展开更多

关键词 普通变形杆菌 扬子鳄 FliL基因 毒力

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猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：6

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作者 梁霄 孙萌 +4 位作者 王鹏程 白娟 王先炜 刘星 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期119-125,共7页

为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法... 为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法对PEDV、TGEV和ACTB的检测灵敏度分别为1、10和10 copies/μL;PEDV和TGEV敏感度为10^(0.02)TCID_(50)和10_(0.05)TCID_(50),高于常规RT-PCR,批内和批间变异系数均小于1%。与猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、乙型脑炎病毒、塞内卡谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。采集124份临床病料样品进行检测,PEDV阳性率为42.74%,TGEV阳性率为8.87%,检测结果与该病毒单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于PEDV和TGEV临床病料检测。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 荧光定量PCR

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牛结节性皮肤病病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：5

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作者 伍子昂 南文龙 +6 位作者 吴晓东 王怡 王俊荣 高雁怩 白娟 杨振 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2022年第11期100-105,共6页

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和... 牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR

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猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定 被引量：4

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作者 王梦婕 张杰 +3 位作者 孙杨杨 白娟 刘星 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期91-96,共6页

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体,将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合,密码子按大肠杆菌偏嗜性优化,构建了大肠杆菌表达质粒,制备获得重组M蛋白。取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白,... 为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体,将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合,密码子按大肠杆菌偏嗜性优化,构建了大肠杆菌表达质粒,制备获得重组M蛋白。取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白,将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合,用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a,3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定,4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应,鉴定出2个抗原表位,为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M蛋白 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立 被引量：3

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作者 张路捷 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1509-1516,共8页

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测11... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

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